Adv Sci丨建立“双小分子协同 + 化学成分明确” 的 ANSCs 诱导体系

神经干细胞（NSCs）作为中枢神经系统（CNS）的 “种子细胞”，具备自我更新与多向分化潜能（可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞），在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）、神经损伤及神经精神疾病（如抑郁症）的细胞治疗中具有不可替代的价值。人多能干细胞（hPSC，包括胚胎干细胞 ESC 和诱导多能干细胞 iPSC）可分化为 NSCs，为临床应用提供了无限的细胞来源。然而，当前 hPSC 向 NSCs 诱导的临床转化仍面临三大核心瓶颈：① 传统方案依赖病毒载体、复杂转录因子或 undefined 培养基，存在成瘤风险、操作繁琐且重复性差；② 诱导的 NSCs 神经谱系定向分化潜能不足，均一性低，难以满足临床治疗的功能需求；③ 分化机制尚未完全阐明，尤其是表观遗传调控与代谢重编程在神经命运决定中的协同作用仍不明确，制约了诱导体系的优化。

为解决这些问题，研究人员尝试通过小分子化合物调控细胞信号通路以优化诱导效率。视黄酸（RA）信号与 Wnt 信号在胚胎神经发育中扮演关键角色，前者通过激活视黄酸受体（RAR）促进神经分化，后者则调控神经前体细胞的增殖与命运决定。TTNPB 作为强效 RAR 激动剂，已被证实参与细胞重编程与分化调控，而 CHIR99021 作为经典 Wnt 信号激活剂，可诱导 hPSC 向 NSCs 分化。但二者协同诱导 hPSC 向 NSCs 分化的效果、核心机制，以及诱导细胞的体内功能验证，此前尚未有系统报道。

近日，内蒙古大学陈杨林、包斯琴、吴智敏、李喜和团队在国际期刊Advanced Science在线发表了一项突破性研究，题为TTNPB Promotes Human Pluripotent Stem Cell-to-Neural Stem Cell Transition via Modulation of Chromatin Accessibility and the S-(5'-adenosyl)-L-homocysteine/Choline Metabolic Network。该研究建立 “TTNPB+CHIR99021” 双小分子协同诱导体系，在化学成分明确的 N2B27 培养基中，从hPSC高效分化出进阶神经干细胞（ANSCs），并通过转录组、ATAC-seq、代谢组学及体内功能实验，系统揭示了 “表观遗传重塑 - 代谢重编程” 协同驱动神经分化的核心机制，且证实 ANSCs 在抑郁模型大鼠中具有显著治疗效果，为神经疾病细胞治疗提供了全新策略。

研究团队首先优化诱导体系：在 N2B27 化学成分明确培养基中，以 3µM CHIR99021（已验证有效浓度）联合不同浓度 TTNPB 处理 hPSC，发现 0.5µM TTNPB 即可显著上调神经外胚层基因（SOX2、PAX6、SOX1）表达，由此确定 “0.5µM TTNPB+3µM CHIR99021+N2B27” 为最优诱导体系，诱导的细胞命名为 ANSCs。进一步验证显示，ANSCs 具有长期自我更新能力，传代超过 50 代仍保持稳定核型与碱性磷酸酶（AP）阳性，显著优于传统 NSCs；免疫荧光与 RNA-seq 证实，ANSCs 低表达多能基因（OCT4、NANOG），高表达神经外胚层关键基因（PAX6、SOX1、NES、NEUROG2），自发分化 9 天后，神经元标志物 TUBB3、胶质细胞标志物 SOX10 表达量显著高于传统 NSCs，且该体系在 H9 ESC、Z1 iPSC 等不同细胞系中均能稳定诱导 ANSCs，证实了体系的普适性。值得注意的是，单独使用 TTNPB 虽能产生一定作用，但无法维持细胞存活与增殖，而 CHIR99021 的存在是 ANSCs 存活的必要条件 —— 去除 CHIR99021 后，仅 TTNPB 处理会导致细胞大量死亡，证实二者的协同作用不仅体现在诱导效率，更体现在细胞稳态维持上。

为探究协同诱导的表观遗传机制，团队对 hPSC、传统 NSCs 和 ANSCs 进行 ATAC-seq 分析，结果显示 ANSCs 的全局染色质可及性显著高于 hPSC 和传统 NSCs，尤其是在转录起始位点（TSS）±3kb 区域，表现出更强的信号富集。具体而言，神经外胚层特异性基因（PAX6、SOX1、NEUROG2）的染色质可及性显著增强，而多能性基因（POU5F1、ZFP42）的可及性显著降低，为神经分化基因的转录激活提供了表观遗传基础；转录因子活性分析显示，ANSCs 中 PAX3/7、HOXB9 等神经谱系转录因子活性升高，AP-1 复合体（JUNB、FOSL1）被激活，而 KLF 家族等多能性转录因子活性受抑制，形成特异性转录调控网络；与传统 NSCs 相比，ANSCs 有 3758 个染色质可及性峰上调，仅 363 个下调，且差异峰主要位于基因间区，提示 TTNPB 可能通过调控远端调控元件增强 CHIR99021 的神经诱导效应。

非靶向代谢组学分析揭示了 ANSCs 的特异性代谢特征：与 hPSC 和传统 NSCs 相比，ANSCs 中 S - 腺苷同型半胱氨酸（SAH）、二磷酸腺苷（ADP）、谷胱甘肽（GSH）、L - 脯氨酸水平显著升高，且这些代谢物与神经外胚层基因表达呈强正相关。进一步功能验证发现，外源性补充 SAH 可显著上调 NSCs 和 hPSC 中神经标志物 NESTIN 的表达（NSCs 中提升 15 倍以上），并诱导 hPSC 形成神经球样结构；胆碱作为磷脂酰胆碱（PC）的代谢产物，补充后可剂量依赖性促进神经分化，50µM 时效果最佳，且与神经基因（NEUROG1、PAX6）表达正相关；机制上，TTNPB 通过激活 RA 信号，直接上调磷脂酰乙醇胺 N - 甲基转移酶（PEMT）的表达（其启动子区域染色质可及性增强），促进磷脂酰乙醇胺（PE）向 PC 转化，进而生成胆碱；同时，SAH 水解产生的同型半胱氨酸可促进 GSH 合成，形成 “TTNPB-PEMT-SAH / 胆碱” 核心代谢网络，为神经分化提供膜结构原料与氧化还原平衡支持。

为验证 ANSCs 的临床应用潜力，团队构建了慢性不可预测温和应激（CUMS）+ 脂多糖（LPS）诱导的抑郁模型大鼠，将 tdTomato 标记的 ANSCs 或传统 NSCs 通过立体定向注射到大鼠海马区。结果显示，移植后 7 天，ANSCs 在大鼠海马区成功定植并存活，且存活数量显著多于传统 NSCs；行为学检测证实，ANSCs 移植组大鼠体重下降幅度减小，蔗糖偏好率显著提升，旷场试验总移动距离、高架十字迷宫开臂停留时间均恢复至接近正常水平，抑郁样行为得到显著改善；分子机制上，移植后大鼠海马区炎症水平降低（脾指数下降），转录组特征向正常对照组靠拢，证实 ANSCs 可通过调节海马微环境、分泌神经营养因子等方式发挥治疗作用。

该研究首次建立了 “双小分子协同 + 化学成分明确” 的 ANSCs 诱导体系，系统阐明了 TTNPB 与 CHIR99021 通过 “表观遗传重塑 - 代谢重编程” 协同驱动 hPSC 向神经干细胞分化的核心机制：TTNPB 作为 “表观遗传调节剂”，增强神经分化基因的染色质可及性，放大 CHIR99021 的神经诱导效应；同时，二者协同激活 SAH / 胆碱代谢网络，为神经命运决定提供内在能量与物质支持。诱导的 ANSCs 不仅具备 “高效分化、长期增殖、安全无毒” 的技术优势，更在抑郁模型中展现出显著治疗效果，为神经疾病的细胞治疗提供了全新的种子细胞来源。此外，该研究还为细胞命运转换的机制研究提供了新范式 —— 首次揭示 RA 信号在神经分化中的 “表观遗传 - 代谢” 双重调控作用，为后续小分子诱导体系的优化提供了理论依据。未来，随着该体系的进一步完善，有望在阿尔茨海默病、脊髓损伤等更多神经疾病模型中开展验证，加速干细胞疗法的临床转化进程。

原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202515648

制版人：十一

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