Nat Immunol | 多发性硬化症中克隆扩增CD8+ T细胞的抗原特异性

撰文 |章台柳

多发性硬化症（ MS ）是一种中枢神经系统（ CNS ）的炎症性脱髓鞘疾病，其中 T 细胞深度参与其病理过程。 CD4+ 和 CD8+ T 细胞均被发现存在于 MS 病灶的血管周围间隙以及脑实质中。相对于 CD4+ T 细胞， CD8+ T 细胞在 MS 病灶中富集并发生克隆性扩增，这表明存在局部抗原驱动的扩增。特定的主要组织相容性复合体（ MHC ） I 类等位基因也会改变 MS 的易感性，这进一步支持了细胞毒性 CD8⁺T 细胞在 MS 生物学中的关键作用。获取中枢神经系统组织以分析MS中的浸润性T细胞反应是侵入性的，并且很少在疾病早期进行。脑脊液（CSF）是淋巴细胞进入中枢神经系统的中转站，为了解中枢神经系统内部的免疫反应提供了一个窗口。对脑脊液免疫细胞库的研究确实表明，其与MS病灶中扩增的T细胞群体存在高度的克隆重叠。这就为识别在中枢神经系统中独特扩增的 T 细胞，尤其是 CD8+ T 细胞，并确定其表型特征和抗原特异性，提供了可行性。

近日 ，来自 加利福尼亚大学旧金山分校的 Joseph J. Sabatino Jr 和 Scott S. Zamvil 团队合作 在 Nature Immunology 杂 志上发表文章 Antigen specificity of clonally enriched CD8+ T cells in multiple sclerosis ，通过对MS队列和对照组个体的脑脊液及血液进行全面的单细胞RNA测序和T细胞受体测序分析，发现了一组23个高度扩增且高度活化的CD8+ T细胞克隆型，这些克隆型主要在MS队列的脑脊液中富集。通过无偏倚和靶向抗原发现方法，鉴定出六种识别EB病毒（EBV）抗原及多种新型模拟表位的CD8+ T细胞克隆型。尽管大多数模拟表位未能引发功能性免疫应答，但从MS患者中发现的三种扩增CD8+ T细胞受体对EBV具有反应性。在脑脊液中检测到EBV DNA和转录本，包括在那些具有高度扩增的EBV特异性CD8+ T细胞的MS患者中。这些发现为理解CD8+ T细胞在MS中的作用提供了重要启示，并支持EBV在MS免疫病理学中的重要作用。

研究共招募了18名个体——11名复发缓解型MS患者，2名临床孤立综合征（CIS）患者，2名其他神经炎症性疾病（OND）患者和3名健康对照（HCs）。MS和CIS（MS/CIS）队列中的所有患者在样本采集时均未接受过治疗（即，既往无免疫调节或免疫抑制剂治疗史），但一名OND患者 正在接受TNF-α抑制剂免疫治疗 。每位参与者在同一天采集配对外周血和脑脊液样本。对新鲜获取的、包含所有未分离细胞亚群的样本，使用10X Genomics 5'建库试剂盒进行配对的scRNA-seq和scTCR-seq，以实现单细胞转录组表型和TCR克隆分析的结合。scRNA - seq分析显示，与 HC/OND 队列相比， MS/CIS 患者中的 CD8+ 和 CD4+ T 细胞都处于更活化的状态，效应功能和归巢能力增强。相对应的， MS/CIS 患者的血液和脑脊液中存在更多样化的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞克隆型。分析克隆扩增的情况，发现在脑脊液中观察到小部分克隆扩增的 CD4+ T 细胞，但在 MS/CIS 组和 HC/OND 组中总体上高度和中度扩增的 CD8+ T 细胞的比例类似。虽然只有1 .5% 的克隆型在两个部位同时存在，但进一步提取出在脑脊液中富集扩增的T细胞克隆型（其脑脊液频率至少是同一个体外周血频率两倍的克隆型），鉴定出33个高度脑脊液富集且扩增的T细胞克隆型，它们在脑脊液中的频率约为外周血频率的2倍到超过100倍不等。结合scRNA - seq分析基因表达，发现脑脊液中高度克隆扩增的T细胞表达的基因特征提示其具有丰富的抗原经历、细胞毒性以及独特的组织归巢能力。

随后，研究人员探究高度扩增的脑脊液富集 CD8+ T 细胞所识别的抗原。首先利用肽：MHC（pMHC）酵母展示文库，该文库在给定的 MHC 等位基因上展示约 1-10×10⁸ 个随机肽段，用于探测单个 TCR 的识别情况。尽管这种无偏倚的抗原发现方法产生了几个CD 8+ T细胞克隆型的新颖模拟表位，这些表位可通过pMHC I四聚体结合检测到，但均未对天然存在的抗原表现出功能性反应性。其次，研究人员在几个公共TCR数据库中查询高度扩增的脑脊液富集TCR克隆型。发现来自参与者 MS8 的一个 CD8 + T 细胞克隆型（ 86333_1456 ）与一个被充分描述的 EB 病毒（ EBV ）表位 EBNA3A 193-201 （ FLRGRAYGL ）的 TCRα 和β序列完全匹配，并且pMHC I四聚体分析验证其特异性，且能够被相关EBV肽段刺激并产生明显的细胞因子，即证明了具有功能。进一步分析显示，在 MS 患者的脑脊液中，至少有三种高度扩增的 CD8+ T 细胞对 EBV 具有特异性，但大多数富集 T 细胞克隆型的特异性仍然未知，且 EBV 特异性 CD8+ T 细胞扩增在 MS 患者的脑脊液中（相比血液）特异增加。将这三种脑脊液扩增的 CD8+ T 细胞克隆型的转录特征与所有其他脑脊液扩增和富集的 CD8+ T 细胞进行比较，发现脑脊液中 EBV 扩增的 CD8+ T 细胞是与滤泡归巢和 B 细胞相互作用相关的效应细胞群。在测试的自身抗原肽段中，未呈现出自身抗原交叉反应性。说明这些克隆扩增的CD 8+ T细胞在脑脊液中的富集可能是由对EBV的反应性驱动的。

那么，EBV是否存在于脑脊液中？从所有参与者的脑脊液中提取DNA，并用EBV BZLF1基因特异性引物进行PCR扩增，并对产物进行Sanger测序，发现在6/13的MS/CIS样本和2/5的HC/OND样本中检测到EBV DNA。通过数字PCR（ddPCR）扩增EBER2基因来进一步量化EBV DNA的存在，发现几乎所有的患者和对照研究参与者的脑脊液中都检测到了EBV，尽管其相对丰度差异很大，其中MS/CIS患者的水平最高。对几种潜伏期和裂解期基因的EBV转录本进行分析，发现在 MS/CIS 队列（包括脑脊液中存在高度扩增的 EBV 特异性 CD8⁺ T 细胞的患者 MS6 、 MS8 和 MS27 ）中观察到 BamHI-W 转录本显著增加，其他潜伏期和早期裂解基因在两组间没有差异。这表明 MS/CIS 患者脑脊液中 EBV 再激活增强，可能驱动了 EBV 特异性 CD8⁺ T 细胞的扩增。

https://www.nature.com/articles/s41590-025-02412-3

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