动物行为实验指南丨光纤记录结合五项选择连续反应时任务（5-CSRTT）

限水阶段

小鼠经过三天的适应性饲养，进入连续8天的限制性供水阶段，供水时间依次为4h、3.5h、3h、2.5h、2h、1.5h、1h、0.5h，在每日上午十点称量其体重，当小鼠体重低于前体重的90%时，可以认为小鼠的限制性断水取得了理想的结果，如低于前重量的80%时，应注意小鼠的健康状况，防止因过量缺水导致行动能力下降甚至死亡。限水结束后进行行为学训练，之后的每天行为训练结束后，定时补水15min。

适应性训练阶段

健康状况达到标准的小鼠，进入到适应性训练阶段，此阶段分为四个阶段：在第一阶段，运行5-choice Habituation1程序（10min），此阶段小鼠可以自由的在操作箱中进行探索，操作箱的屏幕和槽灯此阶段都不会被点亮，也不提供糖水奖励。在第二阶段，运行5-choice Habituation2（30min，100试次），此阶段五孔屏幕灯不会亮，但是食物口槽灯会亮，当小鼠触碰槽灯后将获得液体奖励（2%蔗糖），小鼠通过反复触碰槽灯，在此阶段建立起槽灯和糖水奖励之间的连接。当小鼠完成100试次或者实验累积时间达到30min后一轮实验结束。当获得奖赏的次数≥50次，小鼠进入到第三阶段，否则重复第二阶段，直到达标为止。第三阶段，运行的是5-choice Touch Training程序（30min，100试次），随机点亮5块屏幕(4cm×4cm)，当小鼠触碰屏幕后，操作箱的槽灯被点亮，小鼠触碰被点亮的槽灯后，随即槽口泵出糖水，给予其奖励。接着五块屏幕将随机被点亮（无间隔时间）以进入下一个试次。获得奖励次数≥50次的小鼠进入第四阶段。第四阶段运行的是5-choice Touch Training4程序（30min，100试次），此阶段与第三阶段基本相同，不同之处在于，小鼠获得奖励后，有一个5秒的时间间隔。当小鼠的正确试次≥50次时，就进入到训练阶段。

- 小鼠五孔注意力测试系统，上海欣软 -

训练阶段

小鼠在完成适应性训练阶段后进入到训练阶段。训练阶段为循序渐进的难度递进模式，共有6个阶段。其中阶段1屏幕亮屏时间(Stimulus duration,SD)持续30秒，30s的回合时间(Limited hold,LH)，以及2s的间隔时间(interval,ITI)。首先操作箱的槽灯亮起，小鼠触碰其槽口，测试开始于5s Timeout(TO)之后。然后五块屏幕被随机点亮一个，当小鼠在SD时间内正确的触碰屏幕时，将会出现声音反馈提醒其操作正确。于此同时，槽灯将亮起，在LD时间内小鼠触碰槽口，将给予糖水奖励，随后在ITI之后开始下一个试次。当小鼠的反应为过早(premature)、遗漏(omission)或者不正确（incorrect）时，程序会给予TO惩罚，伴随着操作箱的室灯有5s的亮灯间隔。当小鼠能够连续两天都满足进阶标准时，将进入下一阶段的训练程序。下一阶段的SD和LD时间相对缩短，ITI的时间有所延长。

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测试阶段

一旦小鼠在阶段6中达到稳定的性能，就进入到测试阶段。在光纤钙成像实验中，选择第4阶段（SD5-LH5-ITI5）进行测试。在化学遗传学实验中，选择阶段6（SD1.8-LH5-ITI5）常规测试以及LITI（SD1.8-LH5-ITI7）挑战测试进行实验。每次测试时间为30分钟。

(3)aIC的坐标位点通过使用小鼠脑图谱来确定，确定目标位点后，开始钻孔，钻孔使用颅骨钻直径为0.6mm。如将病毒注射在PVT脑区以及LSv脑区也进行如上准备工作，然后将微量注射器缓缓地插入aIC脑区、PVT脑区以及LSv脑区进行病毒注射。

（4）前侧岛叶（aIC）病毒注射具体坐标为：DV（dorsal-ventral，小鼠脑背侧到腹侧）：-3.2mm、AP（anterior-posterior，前端到后端）：+2.22mm、ML（medial-lateral，内侧到外侧）：+2mm；丘脑室旁核（PVT）具体坐标为：DV：-3mm、AP：-1.46mm、ML：+0.1mm；腹侧外侧隔核具体坐标为：DV：-3.9mm、AP：+0.74mm、ML：+0.6mm。

（5）顺行示踪病毒：AAV-hSyn-EGFP，注射时采取5nl/min注射速度，注射总量为50nl；逆行示踪病毒：rAAV-retro-EGFP，注射时同样采取5nl/min注射速度，注射量也为50nl。在小鼠病毒注射完成后，微量注射器至少停针10min，待10min后，再缓缓地将微量注射器移出来，以防止病毒回流。

在体光纤记录

实验人员在进行在体光纤记录实验前，首先需检查和测试在体光纤的控制仪器运行是否正常。将光纤线缆激光的接口端插入仪器的激发光源端，并旋转使其紧密连接，然后开启激光器，对光纤线电缆的出口进行光强度的检测和观察，避免因部分残缺导致光纤线中间漏光或接触不良。完成设备的调试后，即可开始进行光纤套管的插入工作。实验者先对小鼠进行安抚，避免其受到应激刺激，待小鼠的状态稳定后，将其放置于厚海绵垫上，用手指轻轻的按住小鼠的头部，使其不能够轻易的晃动，用蘸有酒精的棉签擦拭陶瓷光纤，使其保持清洁状态，再将光纤线缆的末端轻轻旋转使其能够插入小鼠头部外侧的陶瓷插芯的尾端中，从而使激光光束能够顺利的通过插芯传导到目标区域处，最后将小鼠缓缓松开，轻放入五孔测试箱中，先让其自由活动5-10min,使其能够适应头部携带的元件。

适应结束后小鼠开始行为学测试，记录小鼠在stage4阶段的钙信号，有30min的测试时间。每只小鼠完成行为学实验后，用75%的酒精擦拭设备箱，以免小鼠气味和排泄物干扰下一只小鼠的测试。最后通过录制的实验视频确定小鼠四个动作（正确、错误、提前、遗漏）发生的时间点，再通过F-Scope软件分析钙信号的峰值变化。

小鼠5-CSRTT模型及评价

选用7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠作为实验鼠，实验开始前进行为期三天的环境适应，再开始四个阶段的适应性训练，小鼠完成适应性训练后，进入到正式训练阶段。此阶段为难度递进式，SD的时间随着训练减短，而ITI的时间随着训练增长，参数的变化要求小鼠更高的注意力。此模型通过四个行为指标来评价小鼠的注意力，为正确反应、错误反应、过早反应以及漏报。对完成5-CSRTT小鼠行为指标进行统计分析，随着Stage的进阶，小鼠的正确次数变多，精确率也相应地提升，而漏报没有差异。表明成功构建了小鼠5-CSRTT模型。

五项选择连续反应时任务（5-CSRTT）

A.5-CSRTT模型构建时间轴。B.5-CSRTT任务的执行过程。C.5-CSRTT行为学数据评价。随着stage的递进，正确次数增多，精确率提高，遗漏无差异

为了进一步确认aIC谷氨酸能神经元与注意力之间的关系，使用在体光纤记录法监测小鼠的神经元活动，可以记录小鼠行为时细胞内钙离子（Ca2+）瞬间的变化。在C57BL/6小鼠的aIC脑区单侧注射AAV-CaMKII-GCaMP6s病毒，剂量为300nl，然后再通过手术将光纤套管植入在aIC上方，待病毒表达后，使用GCaMP6荧光钙传感器记录aIC谷氨酸能神经元群体的活动。小鼠病毒注射后，使其休息一周，再开始5-CSRTT行为学训练。GCaMP6s的表达以及光纤位置的确定通过免疫荧光的方法进行确认。小鼠体内钙信号的测量在5-CSRTT任务中记录，小鼠完成5-CSRTT训练后，且行为稳定后，选择stage4进行在体光纤测试。根据5-CSRTT任务的行为指标，将记录的数据分为四组：正确反应，错误反应，遗漏以及提前反应。为了将aIC谷氨酸能神经元活动与行为指标进行时间的匹配，需将记录的小鼠行为视频与光纤测量系统同步。通过分析数据作者发现，与其他三组行为指标相比，当小鼠在5-CSRTT中响应注意行为时，aIC中谷氨酸能神经元钙离子显著升高，提示aIC谷氨酸能神经元的活性显著增加。当小鼠响应注意行为时面积明显高于其他三组行为。小鼠aIC谷氨酸能神经元响应正确行为时钙离子升高。

响应注意行为时aIC谷氨酸能神经元钙信号激活增强

注意事项

动物在训练过程中会获得一定的奖赏，因此在保证动物正常的生理状态下，需要控制动物的饮食或饮水，以避免动物因为饱腹而减少动机行为，从而影响实验结果。因为对于行为学实验来说，动物保持一个良好的状态很重要，在整个实验过程中，动物训练、测试和喂食的时间应尽量保持一致。其次，应保证同一只实验鼠的训练和测试的五孔设备箱为同一个，从而避免因为环境的微小变化对实验结果的影响。研究人员应根据自己的课题合理化的设置训练参数和测试参数，统计方法尤其需要根据实验设计和数据类型来选择。

参考文献：

• The Paraventricular Nucleus of the Thalamus Is an Important Node in the Emotional Processing Network.[J]. Barson Jessica R;Mack Nancy R;Gao WenJun.Frontiers in behavioral neuroscience,2020

• Heterogeneity in the Paraventricular Thalamus: The Traffic Light of Motivated Behaviors.[J]. McGinty Jacqueline F;Otis James M.Frontiers in behavioral neuroscience,2020

• 马影屏. 小鼠注意力调控核团筛选及其机制初探[D].安徽医科大学,2024.

• Proteomic Profile of a Chronic Binge Ethanol Exposure Model.[J]. Starski Phillip;;Peyton Lee;;Oliveros Alfredo;;Heppelmann Carrie J;;Dasari Surendra;;Choi Doo-Sup.Journal of proteome research,2019

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