精准病理新方向，从IHC到mIHC，伴随诊断正迈入空间病理学时代！

伴随诊断技术正经历从传统免疫组化（IHC）向多重荧光免疫组化（mIHC）的革命性跨越，这一变革深刻反映了精准医疗时代对肿瘤微环境多维解析的迫切需求。

在之前的精准病理系列文章中，我们围绕Claudin18.2、MET、ALK、FRα、MAGE-A4、MMR、PD-L1、HER2等多个核心蛋白靶标，详细拆解了免疫组化（IHC）技术在精准病理伴随诊断中的核心价值，为医生制定治疗方案提供了关键依据。

然而，随着对肿瘤微环境认识的不断深入，单一蛋白靶标分析的局限性日益凸显，无法全面揭示疾病的复杂病理生理状态。因此，多重荧光免疫组化（mIHC）技术应运而生，它可以在一张组织切片上进行多个蛋白靶标染色，通过各靶标在细胞上的单表达或共表达，识别不同细胞亚群的空间关系，正逐步成为伴随诊断领域的新宠。

▲ IHC单重染色 vs. mIHC多重染色

今天，我们来聊聊伴随诊断技术从IHC到mIHC的进化之路。

01

IHC临床价值与固有局限

IHC技术自问世以来，凭借其操作简便、结果直观且可靠的特点，在肿瘤病理诊断中占据了不可替代的地位。它通过抗原-抗体特异性结合的原理，能够在组织切片上精准定位目标蛋白，为肿瘤分型、预后评估及治疗选择提供了重要依据。

IHC技术成功地将众多生物标志物，如Claudin18.2、MET、ALK、FRα、MAGE-A4、MMR、PD-L1、HER2等，从实验室推向了临床常规检测，成为伴随诊断的基石。

然而，IHC的局限性也显而易见：单次检测仅能标记一个蛋白靶标，难以全面反映肿瘤微环境中多种蛋白质之间的相互作用和空间关系。肿瘤微环境犹如一个高度复杂且精密的生态系统，其复杂性远非单个蛋白表达所能涵盖。例如，要评估免疫治疗的真实潜力，我们需要同时了解多个蛋白标志物的复杂表达模式，如肿瘤细胞上的PD-L1表达、周围浸润免疫细胞（如CD8+ T细胞等）的数量、定位及其功能状态。

值得注意的是，IHC可双染，即对同一组织切片进行两种不同标志物的染色，然后通过视觉评估。通常，DAB（棕色）显色剂用于标记一个蛋白靶标，萘酚/快红（或其他红色显色剂）用于标记另一个蛋白靶标。因此，IHC双染我们也常称之为明场mIHC。IHC双染的局限性在于，需选择不同种属一抗，且当显色剂在同一共定位的细胞区室中重叠时，很难确定是否存在双重标记，因为吸光显色剂会结合形成颜色不确定的暗信号。最重要的是，与荧光染料相比，明场显色剂相对较少且吸收光谱比荧光基团更宽，这也意味着明场多重很容易光谱重叠和串色。

因此，传统IHC若要检测多种蛋白标志物，往往需通过连续切片重复染色流程。这不仅造成组织样本的浪费，更关键的是无法捕捉蛋白的原位空间关联——如同我们仅能看到散落各处的拼图碎片，始终无法拼凑出完整的疾病全貌。该局限性在免疫治疗、靶向治疗耐药机制研究中尤为显著，也使得伴随诊断技术的升级迭代迫在眉睫。

▲ 传统单重IHC无法在一张切片上同步展示多维信息

02

mIHC开启空间蛋白解析时代

多重荧光免疫组化（mIHC）正在悄然改变游戏规则。如果说IHC是病理诊断的『单点探测仪』，那mIHC就是『全景雷达』。

▲ mIHC开启空间蛋白解析新时代

作为IHC技术的进阶形态，mIHC最主（成）流（熟）技术是通过酪胺信号放大（TSA）原理（即利用辣根过氧化酶HRP标记的二抗与一抗结合，HRP在过氧化氢环境下催化激活荧光标记的酪胺分子，使荧光底物与抗原表位酪氨酸残基共价结合形成大量荧光信号），使用多色荧光标记不同抗体（每个荧光染料都有自己特定的发射光谱），能在同一张组织切片上同时检测多种生物标志物，清晰呈现它们的空间分布和相互作用关系。因此，mIHC（TSA）也常称之为荧光场mIHC。

▲ mIHC技术原理（对比IHC技术）

▲ mIHC TSA放大机制

▲ mIHC多重染色效果图

这一技术突破，不仅大大提高了检测效率，更通过保留空间位置信息，揭示了肿瘤微环境中细胞间的复杂相互作用。简言之，mIHC与单重IHC的主要区别在于，能够检测和区分组织结构背景中的多个蛋白质靶标，同时不丢失形态或空间信息。

mIHC相较于IHC的优势有：

☑ 突破一抗种属限制问题；

☑ 减少组织样本消耗（特别是小活检/稀有样本）；

☑ 原位实现多蛋白共检和共定位，保留空间信息；

☑ 揭示细胞间相互作用、组织结构和功能状态；

☑ TSA放大，可提高低丰度蛋白的检测灵敏度；

☑ IHC为半定量分析，mIHC可精准定量分析；

☑ mIHC比多轮IHC更具成本效益和时间效率，减少试剂及实验室资源的消耗。

综合而言，mIHC可以解决许多科学问题，包括临床、转化和基础研究应用。这一技术有望在伴随诊断开发中占据重要地位。

03

mIHC在药物临床试验中的应用

尽管目前尚未有用于多重生物标志物检测的mIHC伴随诊断产品获批，但全球范围内的临床试验和企业合作，正在为其伴随诊断落地应用铺路。

近年来，mIHC技术在药物临床试验中的应用日益广泛，成为评估药物疗效和预测患者反应的重要工具。目前，美国国家癌症研究所（NCI）将其纳入肿瘤免疫疗法临床试验指南（CIMACs-CIDC），全球顶尖药企也纷纷采用该技术推进创新疗法与伴随诊断产品研发。

以Akoya Biosciences（现被Quanterix收购）为例，该公司与多家药企合作，利用其先进的mIHC技术平台，开展了多项靶向/免疫药物的临床试验。其中，最重要的进展是在2022年6月28日，Akoya Biosciences与Acrivon Therapeutics宣布合作，共同开发、验证和商业化Acrivon的OncoSignature测试（这是一款基于mIHC技术所开发的前所未有的伴随诊断产品），该测试将用于识别对CHK1/2抑制剂ACR-368治疗最有可能产生反应的癌症患者。

▲ Akoya与Acrivon合作开发首个mIHC伴随诊断产品

2023年11月28日，美国FDA授予了ACR-368 OncoSignature测试的突破性设备认证，这是一款用于识别可能从ACR-368治疗中受益的卵巢癌患者的mIHC检测产品，也是mIHC产品首次获得FDA的突破性医疗器械认证。

2025年2月5日，美国FDA授予了ACR-368 OncoSignature测试的突破性医疗器械认证，这是FDA第二次认定，用于识别可能从ACR-368治疗中受益的子宫内膜癌患者。该认定也反映了FDA的判断，即该设备有望为危及生命或造成不可逆转的削弱人类健康状况的疾病或状况提供更有效的治疗或诊断。

▲ OncoSignature测试：基于mIHC技术所开发的多种生物标志物检测产品，对FFPE样本的多色图像定量分析，如果所有3个生物标志物评分都高于预定阈值，则样品被确定为OncoSignature阳性。

目前来看，若ACR-368药物和ACR-368 OncoSignature Assay一旦同步获批，mIHC技术将迎来临床应用爆发点。

mIHC正逐步成为伴随诊断领域的新宠。

当前，行业内对于mIHC panel的检测，若panel检测≤9色，则称之为多重检测；若panel检测>9色，则称之为超多重检测。一项HPK1抑制剂NDI-101150（临床前数据显示，HPK1抑制剂即使在免疫抑制条件下也可能激活T细胞、B细胞和树突状细胞的抗肿瘤活性）的临床试验中使用了『多重+超多重』的检测方法：2重（CD3, pSLP76）+12重（Ki67, GrzB, Lag3, CD8, PD-1, FoxP3, CD11c, CD3, CD4, CD20, pan-CK），对治疗前和治疗后患者的4um厚FFPE样本进行mIHC检测评估。

研究发现：1）肿瘤活检mIHC证实治疗期间pSLP76的抑制；2）通过mIHC 12重组织免疫表型分析观察到的CD8+ T细胞招募和激活增强，支持了NDI-101150通过调节肿瘤免疫微环境发挥作用的假设。

▲ HPK1抑制剂：mIHC多重+超多重的临床试验

此外，mIHC技术还可以在单张切片上同时实现蛋白和RNA共检，如单RNA检测或RNAscope等。

目前，有上百项关键临床试验中采用了mIHC的空间蛋白组学技术，也表明了空间特征可作为预后和预测治疗获益的指标。预计在近1-2年内，mIHC临床试验将从小型探索性研究向大规模注册研究过渡，最终走向临床应用。

04

mIHC技术已就位，未来正当时

2025年12月19日，国家医保局印发《病理类医疗服务价格项目立项指南（试行）》，其中28项指南明确三项可加收项，第20项特别指出：。这一举措，无疑是国家医保局对mIHC项目加收的明确支持，一次检测锁定多个靶点，为精准医疗筑牢坚实保障。

▲ 国家医保局：IHC检测可以加收多重染色

其实，这一政策出台早有端倪。早在2023年9月28日，国家卫健委、国家中医药局和国家疾病预防控制中心三大权威机构联合发布《全国医疗服务项目技术规范（2023年版）》，将『多色免疫荧光检测』及『数字化荧光病理切片扫描』正式纳入国家级医疗服务收费项目名单。这不仅代表着国家主管部门对mIHC临床价值的高度认可，更为各省市申请mIHC收费提供了有力依据。

此次医保局指南进一步明确加收政策，形成政策闭环，标志着mIHC行业进入规范化发展快车道。

政策东风下，提前布局mIHC全产业链、手握核心产品注册证（包括多色显色试剂盒，全自动免疫组化染色机，多光谱数字病理扫描仪/荧光明场多功能数字病理扫描仪和mIHC智能分析软件）的企业将率先抢占先机。

随着技术的不断进步和成本的逐步降低，mIHC技术有望在伴随诊断领域得到更广泛的应用。未来，mIHC技术将不仅仅局限于肿瘤治疗领域，还将拓展至自身免疫性疾病、神经退行性疾病等多个领域。同时，随着人工智能和大数据技术的融入，mIHC技术将实现更高水平的自动化和智能化分析，为精准医疗的发展注入新的动力。

从IHC到mIHC，伴随诊断技术正经历着从单分子分析到多维度、空间定位分析的深刻变革。mIHC技术以其独特的优势，正在逐步成为肿瘤精准治疗的重要工具。未来，随着技术的不断完善和应用场景的拓展，mIHC技术将为更多患者带来福音，开启精准医疗的新篇章。

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