赵海楠开发Cas12Fold，实现CRISPR-Cas12家族蛋白结构的精准预测

如果基因编辑像用剪刀裁剪DNA序列，那么如何让这把“剪刀”更精准、更高效？

最近，中国农业大学赵海楠团队开发了一款名为Cas12Fold的深度学习框架，专门用于精准预测CRISPR-Cas12家族蛋白的三维结构，克服了通用结构预测模型在处理此类高多样性蛋白时的局限性，为基因编辑工具的理性设计与优化提供结构基础。相关成果以

Cas12Fold Accurately Predicts Cas12 Nuclease Structures to Enable Structure-based Genome-editing Engineering

自CRISPR基因编辑技术问世以来，它已成为生命科学领域最强大的工具之一。除了广为人知的Cas9，Cas12蛋白近年来备受关注。它体积更小、无需tracrRNA、具备非特异性单链DNA切割活性，在基因治疗、农业育种等方面展现出巨大潜力。然而，想要理性改造并优化Cas12蛋白，首先必须看清它的三维结构。传统的实验方法如冷冻电镜成本高、周期长，而通用结构预测工具（如AlphaFold2）在面对序列多样性高、同源性低的Cas12亚型时，往往因无法提取足够的共进化信息而导致预测精度不足。

为解决上述问题，研究团队在AlphaFold2架构基础上，通过引入针对Cas12家族特性的三大优化策略，开发了Cas12Fold框架：

1. 深度进化信息挖掘：团队构建了包含约390万条序列的专用数据库 Cas12FoldDB-seq，显著扩充了多序列比对（MSA）的信息深度，解决了Cas12蛋白进化信息匮乏的问题。

2. 基于结构的模板筛选：建立了结构模板库Cas12FoldDB-struct，采用结构相似性而非单纯的序列相似性来识别关键模板，从而能够有效捕获远程同源蛋白信息。

3. 结构引导的迭代优化：引入了迭代优化机制，使模型能够利用初步预测结果进行自我修正，逐步逼近真实结构，甚至能够捕捉蛋白质在不同功能状态下的构象细节。

在针对30个已解析Cas12蛋白结构的基准测试中，Cas12Fold表现出了显著优于现有主流工具（如AlphaFold2，AlphaFold3，ESMFold等）的性能：

1. 整体精度更高：Cas12Fold的预测置信度（pLDDT）中位数高达91.7，而AlphaFold2与AlphaFold3分别为87.2和88.4。

2. 关键区域更准：在涉及功能的关键区域，如负责靶标识别的REC结构域和负责DNA切割的RuvC结构域，Cas12Fold的预测准确性优势明显。

3. 催化中心细节还原：对于催化必需的DED基序，Cas12Fold能更准确地预测其侧链构象及微环境，为理解酶活机制提供了可靠依据。

Cas12Fold的高精度预测能力不仅提升了结构解析效率，还推动了对Cas12家族的新认知与实际应用：

1. 精准结构准确捕捉Cas12家族进化：研究团队利用Cas12Fold分析了106个AlphaFold2难以预测的Cas12蛋白（dtp-Cas12s）。结果发现，其中一类蛋白（dtp-Cas12.I）虽然序列差异大，但在C端结构域上与Casλ蛋白高度相似。这一发现提供了更精准的Cas12分类系统，有助于理解Cas12家族的进化历程。

2. 指导理性设计：研究团队选取了预测难度高的Cas12j.4进行验证，Cas12Fold给出了高置信度(77.9)的结构模型，而其他工具的得分普遍低于60。通过分析这一高精度模型，研究团队识别出Cas12j.4中可能与DNA结合的关键区域，并基于结构相似性原则，从已知功能的Cas12o1蛋白中引入N608R突变。实验验证表明，该突变体在人类细胞中的基因编辑效率提升了3.3倍。

Cas12Fold的成功表明，在通用AI模型基础上针对特定蛋白家族进行垂直领域的深度优化，是解决复杂生物大分子结构预测难题的有效路径。该方法未来有望扩展至Cas9、TnpB等其他CRISPR系统乃至更多蛋白家族，为合成生物学和结构生物学研究提供更精准的计算工具。

中国农业大学分子设计育种前沿科学中心和农学院赵海楠研究员、杨志佳副研究员为该论文的共同通讯作者。博士后徐峰（现为北京市农林科学院杂交小麦研究所副研究员）、博士生赵子龙和硕士生刘畅为论文共同第一作者。博士生余镁霞、李可、景以林和李沛洋对该工作顺利实施起到重要贡献。赖锦盛教授、鄂立柱副教授、辛蓓蓓副教授、陈建副教授对该工作提供了重要的指导和帮助。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sstr.202500674

制版人：十一

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