《食品科学》：南京财经大学朱珍珠博士等：载姜黄素菠菜外泌体样囊泡的制备及其缓解神经炎症损伤作用

姜黄素（Cur）是从姜黄根茎中提取出的一种天然多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎等多种生物活性。然而，Cur水溶性差且在消化过程中容易被酶降解，口服Cur有60%的剂量被吸收，但其在脑部积累量仍不足以发挥其最佳活性，表现出较低的生物可及性。目前，稳态化递送体系已被广泛开发，包括天然大分子（蛋白质或多糖）、脂质体和食源性胞外囊泡等，它们具有较高的比表面积和表面电荷量、可与配体结合等方面的优势，为定向输送功能因子提供了有利条件。

果蔬来源外泌体样囊泡（ELNs）作为纳米级囊泡，在生理环境下具有尺寸效应，类似脂质体，内含核酸和蛋白质及次级代谢产物，在细胞间具有天然的通信功能。ELNs作为递送载体，有助于提高功能因子的生物利用度，增强其营养价值。

菠菜（

Spinacia oleracea

南京财经大学食品科学与工程学院的张梓文、倪露源、朱珍珠* 拟从菠菜中提取SL-ELNs并对其结构和成分进行表征。以SL-ELNs为壁材，装载Cur，制备Cur@SL-ELNs，检测其在体外消化模拟液中释放Cur的情况，探究Cur@SL-ELNs的自适应表面特性。采用小鼠小胶质细胞（BV-2）评估Cur@SL-ELNs细胞摄取能力及其对BV-2细胞增殖的影响。通过脂多糖（LPS）诱导BV-2细胞损伤，比较Cur@SL-ELNs和Cur对细胞因子分泌水平的影响，探究SL-ELNs对姜黄素的生物可及性和抗炎活性的影响。

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SL-ELNs和Cur@SL-ELNs的表征

本研究采用高速离心和超滤相结合的方法，成功从菠菜中提取SL-ELNs（图1A）。经测定，每千克菠菜可提取12.4 g SL-ELNs冻干粉，其中100 mg SL-ELNs中蛋白质含量为3.6 mg、脂质含量为0.6 mg、核酸含量为18 μg。NTA数据显示，上机样品中SL-ELNs粒子浓度为7.6×107个/mL，粒径呈正态分布（图1B）。SL-ELNs原始溶液中，粒子浓度为1.52×109个/mL，蛋白质量浓度为1.8 mg/mL，则纯度为8.44×108个/mg蛋白。这与本课题组前期采用超速离心结合蔗糖密度梯度法提取的大蒜ELNs纯度（2.27×108 个/mg蛋白）相当。本实验中，SL-ELNs的平均粒径为146.8 nm；文献报道，采用尺寸排阻色谱法提取的SL-ELNs平均粒径为135.6 nm，说明不同提取方法得到的ELNs粒径略有差异。TEM图片显示，SL-ELNs为杯状囊泡，具有双层膜结构（图1C）。

Cur为脂溶性分子，与SL-ELNs的双层膜结构具有相容性，故将Cur与SL-ELNs共孵育，并加入皂苷，使Cur装载到SL-ELNs中，制备Cur@SL-ELNs（图1A）。为了考察Cur在SL-ELNs中的包封率，采用HPLC检测透析液和超滤收集的滤液中游离的Cur含量。结果发现，透析24 h后，游离Cur的信号峰均在HPLC的检测限以下，说明透析液中游离的Cur极少，Cur有可能被囊泡完全包埋。为了验证这个结果，将透析24 h后透析袋内的溶液进行多次超滤，取滤液进行HPLC检测。结果证实，超滤后游离的Cur信号微弱。因此，认为Cur完全被SL-ELNs包埋，包封率接近100%。已有研究表明，番茄来源ELNs负载Cur的包封率为0.22%，当ELNs（以蛋白含量计）与Cur投料比为1∶5时，SL-ELNs装载Cur具有更优的包封效率，这可能与ELNs的来源差异有关。NTA数据显示，装载Cur后，Cur@SL-ELNs的粒子浓度为7.1×107个/mL，平均粒径为161.9 nm（图1D）。与SL-ELNs相比，Cur@SL-ELNs平均粒径增加了15.1 nm。同时，Cur@SL-ELNs粒子仍然保持囊泡结构（图1E）。

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Cur@SL-ELNs在体外消化模拟液中可缓慢释放Cur

为了考察Cur@SL-ELNs在消化液中囊泡发生的变化及Cur释放能力，采用体外消化模拟实验进行评估。如图2A、B所示，消化前，Cur@SL-ELNs的水合粒径为（191.7±9.2）nm，Zeta电位为-（8.8±0.9）mV。经口腔消化液后，水合粒径与Zeta电位无显著性变化。Cur@SL-ELNs经胃液消化2 h后，水合粒径增加为（226.9±14.6）nm，Zeta电位为-（6.5±0.3）mV，电位绝对值有所降低。Cur@SL-ELNs经肠液消化2 h后，水合粒径为（250.4±18.3）nm，Zeta电位为-（17.4±0.6）mV，囊泡可能发生聚集。在胃肠消化液作用下中，Cur@SL-ELNs水合粒径的增加，Zeta电位绝对值增加可能是颗粒表面与消化酶发生静电作用或疏水相互作用所致，这与Jiang Dan等发现的装载木犀草素的芝麻叶来源ELNs在模拟胃消化过程变化规律类似。HPLC检测了胃肠消化阶段样品中释放Cur的信号，如图2C所示，在胃消化2 h后，可检测到Cur的信号峰，但是Cur释放量较低；在肠消化阶段，消化2 h，Cur累计释放量达（30.6±3.8）mg，根据生物可及性的计算公式可得，SL-ELNs包载Cur后，Cur的生物可及性达（30.6±3.8）%。文献中游离Cur的生物可及性只有（0.24±0.01）%。消化10 h时，Cur的信号峰最强，释放Cur最多，随着时间的延长，每个时刻释放的Cur逐渐减少，但是Cur释放的总量呈上升趋势（图2D）。肠消化24 h后，Cur的释放量达到（92.1±4.1）mg。以上结果说明，Cur@SL-ELNs在口腔和胃酸环境下保持囊泡结构，到达肠液消化阶段才开始大量释放Cur分子，释放率为（92.1±4.1）%，且表现出持续释放特性，有助于提高Cur生物可及性和生物活性。

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Cur@SL-ELNs具有良好的自适应表面特性

外泌体在进入消化系统或免疫系统时，可对受体细胞产生特异的生物学效应，表现出自适应表面特性。纳米囊泡的粒径和电位随pH值的改变、RB吸附能力和黏蛋白亲和力可反映纳米囊泡在不同环境下表面性质的变化趋势。本研究发现，在中性环境下，Cur@SL-ELNs的水合粒径趋于稳定，变化不大；在弱酸条件下，Cur@SL-ELNs的水合粒径呈现出减小的趋势，说明Cur@SLELNs能够随着环境变化调节自身与周围水分子形成的颗粒大小（图3A）。在同一时刻下，Cur@SL-ELNs的Zeta电位随pH值减小而减小，说明Cur@SL-ELNs在偏酸溶液中稳定性较好（图3B）。采用RB吸附法评价Cur@SLELNs在弱酸性环境下表面疏水性，当纳米囊泡与RB的结合常数K增加时，其表面疏水性增大。然而，随着孵育时间的延长，结合常数K值无明显变化，表明Cur@SLELNs在弱酸性环境下表面疏水性比较稳定（图3D）。采用黏蛋白亲和实验评价Cur@SL-ELNs的表面亲水性，在pH 5.5、6.0、6.8时，Cur@SL-ELNs表现出更强的疏水性，导致黏蛋白聚集程度显著增加；而在pH 7.4时，Cur@SL-ELNs对黏蛋白表现出良好的抗性，黏蛋白聚集程度低（图3C）。结果表明，Cur@SL-ELNs在消化环境中可调整表面结构以适应环境的变化，具有良好的自适应表面特性。已有研究证实，西瓜来源ELNs在不同pH值环境下可通过其脂质层结构的调整保持稳定。在酸性环境中ELNs的双层结构表现出适应性；柠檬来源ELNs的表面富含糖蛋白，能调节免疫系统，适用于过敏反应和自身免疫性疾病的缓解。因此，可以推测Cur@SLELNs具有的自适应表面特性与SL-ELNs的双层膜及膜蛋白有关，这一特性将有利于其被细胞摄取。

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Cur@SL-ELNs被BV-2细胞摄取的情况

为了探究Cur@SL-ELNs能否被BV-2细胞摄取，采用PKH67对Cur@SL-ELNs进行标记，采用DAPI定位细胞核，通过荧光强度的变化监测Cur@SL-ELNs随着时间变化进入BV-2细胞的能力。如图4A所示，当PKH67标记的Cur@SL-ELNs加入细胞2 h后，Cur@SL-ELNs囊泡有一部分开始进入细胞，使细胞中呈现微弱的绿色荧光（强度为8.06±1.64）。随着孵育时间延长到6 h，细胞内绿色荧光逐渐增强（强度为18.29±2.19）。继续延长孵育时间，绿色荧光强度无显著性变化（图4B）。由此可知，Cur@SLELNs在6 h时被BV-2细胞摄取的量达到饱和。已有研究表明，随时间延长，香菇来源ELNs被Caco-2细胞摄取的量增加。本实验与文献报道的结果类似，说明SL-ELNs的囊泡结构有利于递送更多的Cur进入细胞，发挥活性。

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Cur@SL-ELNs对BV-2细胞增殖的影响

为了评估Cur@SL-ELNs对神经损伤的影响，采用小鼠小胶质细胞（BV-2）进行活性评价。由图5A可知，随着Cur质量浓度的增加，BV-2细胞存活率增加，则Cur可促进BV-2细胞生长。如图5B所示，与空白组相比，Cur@SL-ELNs在0～400 ng/mL剂量范围内对BV-2细胞的存活率无显著影响，说明Cur@SL-ELNs的生物相容性良好。然后，本实验使用LPS诱导BV-2细胞模拟神经细胞炎症损伤，探究Cur@SL-ELNs对LPS诱导BV-2细胞的存活率的影响。如图5C所示，与空白组相比，LPS组细胞存活率只有70%。Cur@SL-ELNs预处理细胞后，25 ng/mL的Cur@SL-ELNs即可恢复细胞的存活率接近100%；随着Cur@SL-ELNs质量浓度增加，细胞存活率呈现上升趋势；当Cur@SL-ELNs质量浓度大于200 ng/mL时，细胞存活率有所下降，但是仍大于100%。说明Cur@SL-ELNs在一定质量浓度范围内可降低LPS对BV-2细胞产生的损伤，促进细胞正常生长，这可能是Cur在起作用。

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Cur@SL-ELNs对LPS诱导BV-2细胞炎性细胞因子分泌的影响

LPS刺激细胞后，细胞大量分泌IL-6和IFN-γ等促炎因子。由图6A、B可知，LPS组细胞中IL-6、IFN-γ的分泌量明显高于空白组的分泌量。与LPS组相比，Cur@SLELNs和Cur预处理均可以显著抑制细胞中IL-6和IFN-γ的过量分泌，并呈现剂量依赖性。IL-10是细胞应对炎症时产生的一种抗炎细胞因子，在LPS诱导的BV-2细胞炎症模型中，IL-10的分泌量明显减少。当Cur@SL-ELNs和Cur剂量为25、50、100 ng/mL时均能显著上调IL-10的分泌水平（图6C）。值得注意的是，当剂量为100 ng/mL时，Cur@SL-ELNs作用后细胞分泌的抗炎因子IL-10水平显著高于Cur单独作用于细胞分泌的IL-10水平。结果表明，Cur@SL-ELNs可抑制BV-2细胞促炎因子的过量分泌，上调抗炎因子的分泌量，对小胶质细胞炎症损伤发挥保护作用，可缓解神经细胞炎症。

相比于文献中使用的质量浓度，本研究Cur@SLELNs或Cur所使用的质量浓度小2～3 个数量级。由于SL-ELNs在酸性环境下结构稳定，SL-ELNs包封Cur后，可规避胃酸环境，将有助于增加Cur在神经细胞内的累计浓度。当Cur@SL-ELNs经过消化系统到达远端组织，被BV-2细胞大量摄取后，释放出来Cur，一方面可通过上调抗氧化酶活性、清除自由基增强神经细胞的抗氧化能力；另一方面，Cur通过抑制小胶质细胞过度激活，减少促炎因子释放，降低氧化应激和炎症级联反应，阻断炎症相关信号通路，保护神经元免受损伤。除此之外，作为载体的SL-ELNs，本身携带的蛋白质、脂质和核酸，也有可能发挥一定的协同作用。已有研究发现，人乳来源外泌体通过抑制LPS诱导的BV-2细胞中的免疫反应信号通路减少促炎介质的产生。本团队后续将对Cur@SL-ELNs调控BV-2细胞的生物学效应和潜在的分子机制进行深入研究。

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结论

本实验分离纯化得到的SL-ELNs是天然的纳米级囊泡，以SL-ELNs为壁材装载Cur，成功制备了Cur@SLELNs。Cur@SL-ELNs在口腔和胃液中囊泡结构相对稳定，肠液中破裂，缓慢释放Cur，其有效减弱了消化道不良环境影响。同时，Cur@SL-ELNs在不同pH值环境中能够调节其表面特性，具有高效的黏液渗透性，有利于受体细胞的高效摄取，促使更多的Cur在细胞中积累，从而对受体细胞产生特异的生物学效应。结果发现，Cur@SL-ELNs在较低剂量时可降低LPS对BV-2细胞的生长抑制作用，上调抗炎因子分泌水平，发挥抗炎活性，缓解神经炎症损伤。因此，SL-ELNs的囊泡结构及其自适应表面特性协助Cur克服生理屏障，实现了Cur的稳态化递送，提高其生物利用度，增强其生物学效应。本研究证实了果蔬来源ELNs作为功能因子递送载体的可行性，将为具有神经保护功能的功能食品研发提供新的解决方案。

本文《载姜黄素菠菜外泌体样囊泡的制备及其缓解神经炎症损伤作用》来源于《食品科学》2025年46卷第19期158-166页，作者：张梓文，倪露源，朱珍珠。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250402-017。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：杨倩；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网