CAR-T细胞制造流程：过程控制与质量控制检测

所有临床级CAR-T细胞均在现行药品生产质量管理规范（cGMP）条件下，经过严格的质量控制（QC）检测后制造和放行。迄今为止，生产主要在集中化设施中进行（如市场授权产品），但在去中心化的护理点（PoC）设施（针对多种研究性产品）进行生产也逐渐兴起。在后一种模式下，制造位于临床中心，以便于及时给药和提高物流效率。

尽管个体化CAR-T产品的制造流程存在产品特异性差异，但其总体工作流程是统一的。作为起始材料，根据人类来源物质（SoHO）法规，获取新鲜或冷冻保存的白细胞分离产物。随后所有对分离产物的操作必须在符合GMP的环境中进行，这是先进治疗医药产品（ATMP）法规的要求。这包括在适用时，分离和纯化T细胞（例如CD3+、CD4+和/或CD8+亚群），作为制造过程中的中间产物。

此中间材料也可进行冷冻保存或作为新鲜材料用于后续制造步骤，这些步骤通常包括T细胞激活、转导和扩增。对于激活，通常通过多效性细胞因子（主要是IL-2、IL-7和/或IL-15）结合可溶性抗体或抗体包被微珠提供的抗CD3/CD28刺激来刺激T细胞。为了利用CAR对T细胞进行基因修饰，可以使用病毒平台（例如慢病毒或逆转录病毒）或非病毒平台（例如转座子）。

此外，在某些情况下，会实施基因编辑，例如降低耗竭标志物或同种异体反应性抗原的表达。然后，修饰后的T细胞被扩增至达到所需剂量，通常需要5至14天，尽管某些新方法可将培养期限制在短短几个小时（24-48小时）。

在整个制造过程中，会进行各种过程控制（IPC）和QC测试，以确保最终药物产品（DP）的纯度、安全性和效力（表1）。DP可以以新鲜或冷冻保存的制剂形式给予患者。冷冻保存的DP具有较长的保质期（以年计），为完成放行所需的QC检测以及管理患者最佳治疗窗口提供了更大的灵活性。

新鲜CAR-T细胞DP通常必须在制造完成后1-2天内给予患者，这对在输注前及时完成所有QC检测提出了挑战。这对于无菌检测尤其相关，因为根据药典标准，无菌检测需要至少七天的培养期。为了解决这一限制，新鲜CAR-T细胞输注通常采用两步放行策略。这包括初步有条件放行证书，允许基于短时间内可获得的关键QC参数进行输注，随后在所有强制性检测（包括生物安全性检测）完成后，签发最终放行证书。

表1.在不同CAR-T细胞制造步骤中执行的IPC和放行QC检测

IPC与QC检测

为确保纯度、有效性、安全性和批次一致性，CAR-T细胞DP需经过严格的QC检测。CAR-T细胞DP的质量不仅在最终收获和制剂后为产品放行进行评估，也在整个制造过程中的关键步骤进行评估。此类IPC检测对于早期发现和潜在纠正偏差至关重要，从而最大限度地降低风险并确保最终DP符合预定的质量属性。必要的IPC检测包括但不限于：在离体培养开始时和T细胞分选后，通过流式细胞术分析确定细胞活力、T细胞纯度和细胞计数。此外，在T细胞转导步骤后几天，会测定CAR-T细胞的百分比（表1）。

关于QC放行检测，这些检测通常在最终DP上进行。然而，如果提供了适当的理由，放行检测可以在更早的阶段对药物物质进行。对于所有DP的QC放行检测（表2），需要定义合理设定的可接受标准，以确保安全性、质量与一致性。

根据药典指南，每个CAR-T细胞批次必须进行含量（细胞组成）、鉴别（CAR表达）和纯度（（CAR）T细胞百分比）检测。此外，必须进行无菌性、支原体和内毒素检测以确保产品安全。在产品开发过程中，需要对药物产品的生物活性进行进一步表征，以建立相关的效价测定方法。该测定应反映CAR-T细胞的作用机制（MoA），即抗原特异性触发CAR后T细胞的激活。由于可接受标准通常基于临床评估开始时有限的DP生产批次，其性质本质上是初步的，应在进一步开发过程中审查和调整。

在特定情况下，例如自体新鲜CAR-T产品，完整的放行检测可能在患者给药前无法完成。在此类情况下，必须实施基于风险的方法，以证明在输注前使用一组更为有限的可用检测结果是合理的，完整的QC检测结果在治疗后获得。虽然合格方法在早期开发阶段是可接受的，但到II期结束时以及注册试验阶段需要完全验证的分析方法（图1）。这一要求与确保产品可比性的需求密切相关，例如在不同制造场地之间。这不仅对于证明授权CAR-T细胞产品全球供应的一致性至关重要，而且在为PoC策略启动多个制造中心的情况下也相关。由于起始材料、设备和操作人员专业知识的差异很大——这些因素都可能影响产品质量属性和批次间一致性——实施可比性研究面临着重大挑战。

表2.QC放行检测总结及对应的欧洲药典（EP）章节和欧盟指南，这些是分析方法开发所必需的

图1.CAR-T细胞DP从早期开发到市场授权所需的方法验证要求

效价测定

如上所述，CAR-T细胞DP的放行严格依赖于对特定定性和/或定量特性的评估，这些特性被称为关键质量属性（CQA），并参照预定的可接受标准进行评估。其中，效价是一个关键属性，根据美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的指南，必须作为每个CAR-T细胞批次放行所需的QC检测的一部分进行评估。

根据ICH Q6B，效价被定义为对DP生物活性的度量，通过与其相关生物学特性及产品所声称的MoA相关联的定量测定进行评估。值得注意的是，并不要求开发与患者预后具有预测相关性的测定方法。因此，效价应仅被视为一个放行规格。在CAR-T细胞的背景下，效价测定旨在测试CAR-T细胞批次识别和消除肿瘤细胞的功能质量，例如通过测量与表达靶抗原的肿瘤细胞共培养后细胞因子的释放（主要是IFN-γ）、T细胞增殖或抗肿瘤细胞毒性。

CAR-T细胞MoA的高度复杂性和错综性使得难以定义一种能够完全代表其潜在生物活性的单一测定方法。事实上，FDA和EMA建议在初始临床阶段尽早建立多种潜在的效价测定方法，以便最终确定并验证用于关键试验的最佳效价测试。此外，FDA建议在产品放行时使用多种测定（即所谓的矩阵测定方法）来测量效价的不同方面，包括（1）细胞活力，（2）载体转导效率，（3）CAR表达，（4）细胞毒性和（5）细胞因子产生。

尽管每种效价测定都有其特定的特点，但目前尚无一种适用于所有不同CAR-T细胞产品的通用解决方案，能够支持在所有情况下优先选择某一种方法。最佳测定方法的识别与开发需要应对几个关键挑战，包括：1）放行检测的时间限制（例如，对于新鲜DP），2）可用于测试的实验材料有限（例如，制造时间非常短的CAR-T制造），3）商业化的全球可用参考标准和对照品有限，4）不同中心之间的差异性。最后，效价测定代表了一项CQA，它作为病毒载体鉴定、DP稳定性评估以及制造中心间可比性研究的基础——无论是遵循集中式还是分散式生产模式。

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