科学通报 | 额外X染色体多维度影响男性胎儿生殖细胞发育

生殖健康依赖于胎儿生殖细胞(fetal germ cell, FGC)的正常发育, 在人类中, 这一过程受到复杂而精密的调控. 其中, X连锁基因的剂量在人类FGC的发育过程中受到精确调节 [ 1 , 2 ] . 研究表明人类FGC在早期发育过程中存在X染色体重新激活(X-chromosome reactivation, XCR)的现象, 导致雌性FGCs中X连锁基因的剂量约为雄性FGC的1.6倍 [2] . 与此同时雄性FGC中X连锁基因与常染色体基因的表达比率低于1, 且该比率低于周围体细胞中的水平 [3] , 这证明雄性FGC的发育需要相对较低剂量的X连锁基因. 然而, 对于异常剂量的X连锁基因如何损害人类FGC的发育, 目前仍知之甚少.

克氏综合征(Klinefelter syndrome, KS)是男性最常见的性染色体异常疾病之一, 影响约1/600的男性群体 [4] . 这类患者比正常男性(46, XY)多出一条X染色体, 其染色体为(47, XXY), 其典型临床表现为青春期后生殖细胞大量丢失、睾丸组织纤维化以及无精子症, 导致生育能力严重受损 [5] . 既往研究多聚焦于患者青春期后阶段, 此时生殖细胞已基本丢失, 目前仅记录到性腺体细胞有限分子异常 [ 6 , 7 ] , 而KS患者不育的根本原因和起始事件, 尤其是生殖细胞早期发育缺陷及相关分子调控异常的机制尚不明确.

针对以上问题, 2024年, 北京大学第三医院乔杰团队在 Nature 发表题为“How the extra X chromosome impairs the development of male fetal germ cells”的研究论文. 该团队基于前期发现的人类FGC在早期发育过程中存在XCR这一关键特征, 以KS患者FGC额外携带一条X染色体的特点作为天然研究模型, 以胎儿期生殖细胞研究为揭示发育异常的关键切入点, 揭示了X染色体剂量异常导致男性胎儿生殖细胞发育障碍的关键机制 [8] .

研究首先明确了KS患者的FGC在胎儿阶段就出现了发育异常. 研究选用KS胎儿、男性和女性对照胎儿的性腺为研究对象, 进行后续多项研究. 单细胞转录组测序分析和免疫荧光染色发现, KS患者性腺中FGC处于早期阶段的比例显著高于男性对照. 与此同时, 两组的FGC总数无显著差异, 提示KS患者的FGC存在发育阻滞而非细胞丢失. 这一发现有力颠覆了将生殖细胞丢失主要归因于青春期事件的传统观点, 证明发育障碍早在出生前就已发生.

进而, 该研究深入解析了KS患者的FGC的基因表达谱, 发现其存在显著的基因调控失常. 在早期FGC中, 组蛋白修饰、WNT(wingless-related integration site)/TGF-β(transforming growth factor-β)、去甲基化等通路基因上调, 而分化相关基因, 如piRNA代谢、减数分裂相关基因则表达下调, 且NODAL信号增强、多能性提高等, 表明早期FGC多能性增强而分化潜能降低. 而在晚期FGC中, DNA复制、染色体分离相关基因上调, 表明细胞未完全进入有丝分裂停滞期, 同时迁移及早期FGC标志物上调, 向精原细胞过渡的关键基因下调, 整体显示晚期FGC仍处于幼稚状态.

与此同时, 研究团队发现额外X染色体对KS患者的FGC的转录失调和发育缺陷具有关键影响. 首先, 研究团队通过等位基因表达分析和免疫荧光染色证实了KS患者的FGC中两条X染色体均处于活跃状态. 随后通过RNA/DNA/蛋白三重荧光原位检测技术(triple in situ fluorescence, TISF)结合空间统计学算法深入探究了X染色体失活(X chromosome Inactivation, XCI)失败的具体机制. 研究发现, 启动XCI的长链非编码RNA——X失活特异性转录本(X-inactive specific transcript, XIST)在KS患者的FGC中虽有表达, 并随FGC分化逐渐下调直至消失, 但并未能介导XCI. 与此同时, 人类特异性长链非编码RNA——X染色体活性涂层转录本(X-active coating transcript, XACT)在KS患者的FGC中表达更为广泛, 同样随细胞分化而下调并消失. 既往研究表明, XACT可干扰XIST的表达与定位, 进而影响其功能 [ 9 , 10 ] . 本研究的空间共定位分析进一步发现, 在KS患者的FGC中, 部分XACT定位于XIST所形成的“云”状结构内部, 提示XACT可能通过物理阻碍XIST附着于X染色体, 从而拮抗其沉默功能, 导致XCI无法发生. 结合其他人类FGC的研究数据, 推测FGC中XCI缺失的潜在机制可能还包括: XIST无法有效覆盖X染色体、XACT的拮抗作用以及其他尚未阐明的机制. 此外由于存在两条活跃的X染色体, KS患者的FGC中X连锁基因的表达剂量远高于男性对照, 早期为男性对照的1.68倍, 晚期为1.59倍. 值得注意的是, 上调的X连锁基因显著富集于大多数与FGC发育缺陷相关的关键通路中, 直接干扰WNT通路、组蛋白修饰、细胞周期等关键生物学过程, 并抑制X连锁的癌/睾丸抗原(X-linked cancer-testis antigen genes, CTX)基因介导的精原干细胞分化程序, 最终损害KS患者的FGC发育.

此外, 研究发现KS患者的FGC表观遗传异常也可能是其发育阻滞的原因. 通过单细胞三组学测序(scTrio-seq)表征性腺细胞的DNA甲基化图谱, 发现KS患者的FGC经历异常的DNA甲基化重编程. KS早期FGC整体甲基化水平低于对照组, 且关键印记控制区经历更彻底的擦除. 尽管基因表达与启动子甲基化整体关联有限, 但KS晚期FGC中 CTX 基因启动子甲基化水平显著升高, 可能导致其表达降低, 从而阻碍分化. 此外, KS患者的FGC中特定重复元件(SINE-VNTR-Alu, SVA)呈现高甲基化, 其异常表观状态可能参与发育阻滞 [ 11 , 12 ] .

生殖细胞发育不仅依赖内在基因程序, 也受周围体细胞微环境的精细调控. 除发育阻滞外, 迁移受损是导致KS患者生殖细胞减少的另一关键因素. 在正常男性胎儿中, 支持细胞与晚期FGC于妊娠后期向睾丸索基底部迁移, 期间晚期FGC进一步分化为精原干细胞. 反之, 若无法完成迁移, 晚期FGC则会因分化异常死亡 [ 13 ~ 15 ] . 由此, 研究团队通过单细胞转录组学(single-cell transcriptomics)技术, 描绘了KS患者的性腺体细胞的转录特征及其与FGC的相互作用. 结果表明, KS患者的分化支持细胞亚群(SC1和SC2)中, 与发育、迁移、黏附及细胞骨架相关基因表达显著下调, 表明KS的支持细胞谱系存在缺陷, 其迁移和运动功能受到损害. 并且使用CellChat分析性腺细胞间的相互作用时发现, 除了WNT和TGF-β通路的过度激活外, 迁移相关的互作信号也显著减少, 免疫荧光验证了这种相互作用缺陷. 此外, 空间组学(stereo-seq)和免疫荧光显示, 男性对照中的晚期FGC倾向于分布在生精小管的基底区域, 而KS患者中的晚期FGC则更倾向于分布在小管中心, 且KS患者的支持细胞核层厚度更大、晚期FGC基底分布比例更低, 证实支持细胞与FGC向基底膜的迁移受损.

最后, 该研究采用体外性腺培养系统探究KS患者FGC的分化能力及潜在的治疗干预手段. 研究发现正常男性胎儿性腺组织在体外可以有效分化, 而KS胎儿性腺组织未出现分化. 但是, 当使用TGF-β抑制剂SB431542处理4例KS性腺组织后, 3例组织的分化能力显著提升, 另1例也呈现上升趋势, 证实了KS生殖细胞分化能力低下, 但靶向抑制TGF-β通路可有效改善其分化阻滞.

综上所述, 该研究深入探究KS患者的生殖细胞发育异常, 首次系统揭示了额外X染色体通过多维度机制破坏男性生殖细胞发育的完整图景, 探明了KS患者生殖细胞丢失的核心机制: KS患者的FGC中额外X染色体逃避失活, 导致X连锁基因异常高表达, 进而引发一系列下游通路紊乱, 导致FGC发育阻滞; 同时, 表观遗传层面的异常可能进一步加剧了阻滞. 此外, 支持细胞迁移能力的下降及细胞通讯减弱, 致使FGC无法向睾丸索基底部迁移, 造成迁移受损, 形成了“发育阻滞-迁移受阻”的恶性循环, 最终都会导致其出生后生殖细胞数量减少. 不仅如此, 该研究还创新性地提出靶向干预策略, 发现TGF-β抑制剂可以恢复KS性腺组织的分化能力, 改善发育障碍( 图1 ).

图1 额外X染色体多维度影响男性胎儿生殖细胞发育机制图

值得注意的是, 尽管该研究取得了上述成果, 但仍存在若干有待完善之处, 这也为后续相关领域的深入探索指明了重要方向. 首先, 当前采用的体外培养系统是一个高度简化且受控的环境, 虽能精确控制变量, 但与体内真实的睾丸微环境仍存在差异. 因此未来研究需建立更接近生理条件的模型或者开展临床试验, 以验证TGF-β抑制剂在复杂微环境中的促分化效力. 其次, 研究提示TGF-β抑制剂对嵌合型KS患者可能同样适用甚至更具潜力, 但这一假设仍需通过直接实验验证. 未来通过纳入嵌合型患者样本, 有望揭示其生殖细胞异质性对药物响应的具体机制, 为该类患者的精准治疗提供依据. 最后, TGF-β在多种生理过程中至关重要, 系统性抑制该通路可能会对生殖系统以外的器官或功能产生不良影响. 因此, 系统评估该抑制剂的潜在副作用及组织特异性安全性, 将是走向应用前不可或缺的一环.

然而该研究依旧填补了生殖发育生物学的重要空白, 开创了遗传性不育症的胎儿期机制解析与干预先河. 相信随着未来研究的深入, 针对克氏综合征等遗传性不育症的早期干预策略将逐步成熟, 最终实现从“机制解析”到“生育力挽救”的跨越.

参考文献

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