生物制品中细胞冻存保护液DMSO等残留分析检测

细胞冻存保护液残留

细胞冻存是细胞生物学研究及药物研发细胞实验中需要经常面对的常规操作。冻存保护液从成分可划分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂。常见的渗透性保护剂如二甲基亚砜（DMSO）、甘油等，能穿透细胞膜降低冰点；而非渗透性保护剂如蔗糖、羟乙基淀粉、葡聚糖等则在细胞外部形成保护环境。

在生物制品生产与临床治疗中，细胞冻存保护液是维持细胞活性和功能完整性的关键因素。然而不完全的清洗过程导致保护液成分在最终产品中残留，带来安全性风险和有效性隐患。

冻存保护液残留分析案例

01.DMSO二甲基亚砜

DMSO二甲基亚砜是目前最常用的冷冻保护剂，它可以有效地降低细胞在冷冻过程中的冰晶形成，从而保护细胞免受冰晶造成的机械损伤。还能通过其渗透作用，帮助细胞在低温下维持适当的渗透压，防止细胞因渗透压失衡而破裂。

图1.DMSO和空白溶剂典型图谱

微源检测技术团队开发了某发酵多糖凝胶中DMSO残留分析方法，采用DB-FFAP毛细管柱（30m×0.32mm×0.5µm）分离样品，柱温采用程序升温方式，氢火焰离子化（FID）检测器。二甲亚砜与溶剂峰完全分离，DMSO在0.1~10µg/mL浓度范围内线性关系良好，平均回收率为99.97%。

图2.DMSO分解机理

*注意：在开发部分酸性生物制品中DMSO含量分析方法时，顶空加热至80℃以上易分解为甲硫醚、二甲基二硫醚和甲硫醇。建立检测方法时，选用顶空进样方法测定时应避免高温孵育/平衡。

02.胎牛血清

胎牛血清（FBS）是另一种重要的细胞冻存液成分，它含有丰富的蛋白质、生长因子和其他营养物质。这些成分不仅为细胞提供必要的营养支持，还能在细胞冻存过程中起到保护作用。

牛血清白蛋白(BSA)是FBS中的主要成分(约为35-50mg/ml)，包含607个氨基酸残基，分子量为66.446KDa，等电点为4.7。虽然在生物制品的制备过程中经纯化可以去除大部分的BSA，但微量BSA依然会存在于生物制剂成品中。

作为一种异源蛋白的代表，超过一定浓度的BSA能够引起机体的多种免疫反应，引起严重的副作用，从而影响生物制品的安全性。针对生物制品中BSA含量分析策略，技术团队也有过专题性的研究，详见往期文章。

03.肝素

肝素作为一种抗凝剂，在细胞冻存液中的作用主要是防止细胞在冻存过程中发生凝集。细胞凝集会导致细胞在解冻后难以分散，从而影响细胞的复苏效果和后续实验的进行。通过加入适量的肝素，可以有效地防止细胞凝集，确保细胞在冻存和复苏过程中的均匀分布。

肝素是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的粘多糖硫酸酯，技术团队按需开发了某生物制品中低分子肝素和硫酸肝素含量分析方法。

采用LC-HRMS，选用Waters ACQUITY UPLC Peptide BEH C18，300 Å，2.1×100mm色谱柱，对UA-GlcNAc (IVA)、$UA2S GlcNAc (IIIA)、$UA-GlcNAc6S (IIA)、$UA-GlcNS (IVS)、$UA2S GlcNAC6S (IA)、$UA2S-GlcNS (IIIS)、$UA-GlcNS6S (IIS)、$UA2S GlcNS6S (IS) 和 $UA2S-GlcNCOEt6S (I-P)进行了定量分析。选用2mM乙酸钙（含0.01单位肝素裂解酶）对肝素及样品在20mM乙酸铵溶液中进行消化，37℃孵育过夜，并用甲醇进行淬灭。方法重现性高，灵敏度高。

图3.八种肝素分子前体离子

04.葡萄糖

葡萄糖是细胞冻存液中的能量来源之一。在冷冻过程中，细胞代谢活动减缓，但仍需要一定的能量来维持其基本生理功能。葡萄糖可以通过糖解作用为细胞提供能量，帮助细胞在复苏后迅速恢复活力。此外，细胞冻存液中也可能存在蔗糖、果糖等。

针对某低剂量生物制剂，微源检测杂质研究团队开发了以乳糖为内标，测定其葡萄糖、蔗糖和果糖含量分析方法。方法选择CAD检测器，以0.2%三乙胺-乙腈为流动相，选择Amide酰胺基柱等度分析，柱温30℃，流速1mL/min，雾化温度50℃。

图4.系统适用性图谱

而对于大剂量生物制剂而言，其残留限度较低，需开发灵敏度更高的分析方法。针对性开发了以PMP柱前衍生单糖，HPLC或LCMS测定衍生物间接反映单糖残留的分析方法。其中HPLC方法，浓度在0.05μg/mL~5μg/mL范围内，线性相关系数r=0.9998，回收率良好。

图5.PMP衍生葡萄糖机理

图6.HPLC测定葡萄糖衍生产物对照图谱

而选择LCMS对葡萄糖衍生物进行分析，选择[M+H]+m/z=511.00为采集离子，方法灵敏度在0.5ng/mL，在0.5ng/mL~20ng/mL浓度范围内线性良好（r=0.9991）。

图7.LCMS测定葡萄糖衍生产物TIC及其EIC图谱

细胞冻存液残留的分析是一套基于风险、服务于产品的系统性控制策略。随着细胞治疗产品以及传统生物制品的质量要求的提高，冻存保护液等残留物的特性和风险分析已成为生物制品质量控制体系中重要一环。

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