神经环路应用（36）丨RNA干扰技术应用案例简介

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种高度特异性的基因沉默技术，通过降解靶基因的mRNA，从而在转录后水平抑制其表达。RNAi已成为神经科学、发育生物学、药物研发等领域不可或缺的研究工具。

原理

小干扰RNA（siRNA）：外源导入的双链RNA（约21–23 nt），经RISC复合体加载后引导靶mRNA切割。

短发夹RNA（shRNA）：通过病毒或质粒载体在细胞内表达，经Dicer酶加工为siRNA，实现长期稳定沉默。

在神经环路研究中的应用

1. 靶向特定脑区或细胞类型的基因敲低

将携带shRNA的AAV病毒注射到目标脑区，实现局部基因沉默。

结合细胞类型特异性启动子实现细胞选择性敲低。

2. 与行为学结合，解析基因功能

案例：验证VMH神经元内Cav3.1通道是否介导慢性应激-诱发的簇状放电并导致焦虑/代谢共病

RNA干扰技术特异性地敲低腹内侧下丘脑（dmVMH）神经元中Cav3.1钙通道的表达，以验证其在慢性应激诱导的焦虑样行为和能量代谢异常中的关键作用。

实验步骤

1. RNA干扰靶点与设计

靶基因：Cav3.1（T型钙通道的一个亚型）

目标细胞群：dmVMH中的SF-1阳性神经元（调控焦虑与代谢的关键神经元亚群）

干扰方式：采用DIO系统构建的shRNA干扰载体，实现条件性、细胞特异性地敲低Cav3.1表达。

病毒注射：

在慢性应激暴露前，将Cav3.1-shRNA或对照病毒载体双侧微量注射至小鼠dmVMH区域。

特异性表达：

通过SF-1神经元特异性启动子驱动shRNA表达，确保只在目标神经元中干扰Cav3.1。

验证效率：

免疫荧光：确认Cav3.1蛋白表达在dmVMH中显著下降。

qRT-PCR：在组织水平上验证Cav3.1 mRNA水平下降。

单细胞qPCR：在电生理记录后收集单个神经元，进一步确认Cav3.1表达在簇状放电神经元中显著升高，而RNAi后表达下降。

功能验证

电生理记录：

在对照组中，慢性应激小鼠约50%的dmVMH神经元出现簇状放电。

在Cav3.1-shRNA组中，仅约18%的神经元出现簇状放电，表明Cav3.1的RNAi显著抑制了神经元的过度兴奋性。

钙信号成像：

在体钙信号记录显示，Cav3.1敲低后，SF-1神经元的自发钙活动显著下降，进一步支持其在调控神经元活性中的作用。

行为与代谢表型

焦虑样行为：

Cav3.1敲低小鼠在高架十字迷宫和旷场测试中表现出焦虑样行为显著缓解。

能量代谢：

食物摄入增加，能量消耗趋于正常，代谢紊乱得到改善。

Fig1 AAV-DIO-shRNA 敲低 dmVMH 中Cav3.1对焦虑行为、代谢的逆转效果

RNA干扰的意义

因果验证：RNAi技术帮助明确了Cav3.1在慢性应激诱导的神经元簇状放电中的因果性作用。

总结

RNA干扰是一种灵活、高效且可体内应用的基因功能研究工具，尤其适合在复杂神经环路中进行局部、细胞类型特异性的功能缺失。尽管CRISPR/Cas9等基因编辑技术兴起，RNAi因其可逆性、剂量可控性和适用于成年动物等优势仍在神经环路机制研究中占据重要地位。

文献引用：

• Shao J, Gao DS, Liu YH, Chen SP, Liu N, Zhang L, Zhou XY, Xiao Q, Wang LP, Hu HL, Yang F. Cav3.1-driven bursting firing in ventromedial hypothalamic neurons exerts dual control of anxiety-like behavior and energy expenditure. Mol Psychiatry. 2022 Jun;27(6):2901-2913. doi: 10.1038/s41380-022-01513-x. Epub 2022 Mar 22. PMID: 35318460; PMCID: PMC9156408.

• Beverly L. Davidson, Ryan L. Boudreau,RNA Interference: A Tool for Querying Nervous System Function and an Emerging Therapy,Neuron,Volume 53, Issue 6,2007,Pages 781-788,ISSN 0896-6273, https://doi.org/10.1016/j.neuron.2007.02.020.

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