神经环路应用（35）丨RNAscope技术简介及原位杂交实验方法

RNAscope是一种高灵敏度、高特异性的原位杂交（ISH），广泛应用于组织切片中单细胞甚至亚细胞水平的RNA定位与定量检测。

Fig1 RNAscope流程简图

主要优势

单分子灵敏度：可在显微镜下看到离散的“点”，每个点代表一个RNA转录本；

高特异性：双Z探针设计可区分单碱基差异（如SNP、剪接变体、突变 vs 野生型）；

多重检测：支持2–4色荧光或与IHC联用；

半定量分析：可通过点计数进行细胞间表达水平比较；

保留组织结构：适用于神经科学中的脑区定位、细胞类型共标等。

脑组织提取

药物注射与脑组织采集分两天进行。

第1天：对小鼠称重后，腹腔注射F17464或生理盐水，并将其单独置于笼中。30分钟后，再次腹腔注射MK-801或生理盐水，随后将小鼠放回原笼继续饲养60分钟。此后，每隔4分钟取出一只小鼠，通过颈椎脱臼法实施安乐死随即断头。在无RNA酶条件下，迅速取出脑组织，用生理盐水轻柔冲洗，吸水纸吸干多余液体并按以下程序快速冷冻。

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脑组织冷冻

将8个Pyrex烧杯各加入250 ml异戊烷，置于装有干冰颗粒的聚苯乙烯泡沫箱中并在通风橱下排列成一行。使用超低温温度计监测异戊烷温度。当温度降至−20°C时，用刮刀快速搅拌异戊烷形成漩涡。将小鼠脑组织轻轻置于漩涡表面，使其迅速沉底并完成冷冻。随后，将含样本的烧杯继续置于干冰上静置30分钟，使组织温度充分平衡至干冰温度。

该方法可在血管离断后4分钟内实现大批量小鼠脑组织的均匀快速冷冻，有效保存组织形态及100%的目标mRNA，这对于低至中等表达水平的mRNA尤为重要。相比之下，石蜡包埋组织约损失25%的mRNA信号。需注意，若使用液氮等更低温度冷冻某些组织可能出现裂纹导致后续切片困难。整个操作在通风橱中进行并全程使用无RNA酶耗材。冷冻后的脑组织存放于−80°C的15 ml无RNA酶Eppendorf管中。第2天对剩余20只小鼠重复相同流程。所有冷冻脑样本用于RNAscope原位杂交检测c-fos mRNA表达。

RNAscope原位杂交实验方法

采用RNAscope®荧光原位杂交（FISH）技术检测小鼠脑组织中c-fos mRNA的表达水平。实验使用4%多聚甲醛后固定的冷冻冠状脑切片（10 μm厚）。选定5分钟轻度消化作为标准流程，因其在保持组织形态完整性的同时获得最佳信噪比。

所有染色操作均在Leica Bond RX全自动染色平台上进行，使用ACD Bio（Advanced Cell Diagnostics）试剂与探针。每轮实验同步包含以下探针：目标探针 Mm-fos、阳性对照探针 Mm-PPIB和阴性对照探针 DapB。

染色流程依次为：ACD蛋白酶K处理→ 探针杂交→ 信号放大→ LS缓冲液清洗 → Mixed Red Refine显色 → DAPI复染细胞核。染色完成后，载玻片经去离子水冲洗，60°C烘干，二甲苯透明并以Ecomount封片剂封片。封片后立即进行全片扫描或于–20°C避光短期保存。该流程基于ACD Bio的多级分支DNA（bDNA）信号放大系统，在保证高特异性的同时实现单分子mRNA的可视化，为后续定量分析奠定基础。

总结

RNAscope 技术是神经环路研究中精准定位基因表达的核心工具，凭借单分子级灵敏度、高空间分辨率及多靶标同时检测的优势能在组织原位实现特定 RNA 的高分辨率可视化，其核心应用包括通过靶向神经元标志物 RNA（如 Slc17a7、Gad1）精准鉴定环路细胞构成，结合神经示踪技术同步检测投射神经元与功能基因（如受体、离子通道 RNA）以揭示环路连接与基因表型的关联，以及在发育或病理状态下追踪突触蛋白、神经递质合成酶等关键基因的时空表达变化以阐明环路可塑性机制，为解析神经环路的组成与功能提供了关键技术支撑。

文献引用：

• Cosi C, Millar M, Beltran M, Sherry L, Gatti-McArthur S. Quantitative analysis of RNAscope staining for c-fos expression in mouse brain tissue as a measure of Neuronal Activation. MethodsX. 2021 Apr 20;8:101348. doi: 10.1016/j.mex.2021.101348. PMID: 34430251; PMCID: PMC8374392.

• Hazra R, Spector DL. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Front Cell Dev Biol. 2022 Oct 4;10:986261. doi: 10.3389/fcell.2022.986261. PMID: 36268512; PMCID: PMC9577017.

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