兰州大学雷新响课题组Angew：巯基-烯烃光点击化学在双环肽高效合成与基因编码肽库构建中的应用

近年来，环肽因其卓越的高亲和性、优异的代谢稳定性及其在靶向“难成药”靶点方面的独特优势，逐渐成为药物研发领域的研究热点。噬菌体展示技术作为一种高效、便捷的筛选平台，已被广泛应用于肽类候选分子的发现。然而，如何在噬菌体展示平台上实现高效的环肽文库构建与功能筛选，仍然面临着显著的挑战。为克服这一瓶颈，亟需发展一种反应操作简便、生物相容性良好、底物适用性广泛且能够提供精确位点选择性的环化策略，以推动环肽药物的高效发现与应用。

兰州大学雷新响教授课题组近年来致力于针对潜在药用靶点发掘活性环肽的研究，并在噬菌体展示多肽筛选领域开展了相关探索，成功地将化学成环策略（以邻苯二甲醛与异硫氰酸酯为主导）及酶催化成环策略应用于噬菌体展示平台上（

New. J. Chem.

Chem. Sci.

ChemRxiv.

. Am. Chem. Soc.

传统的双环肽构建方法，如TBMB、TBAB和TATA，常因与亲核性残基发生竞争性副反应，导致反应效率下降、色谱分离困难，且在生物环境中的兼容性有限。基于铋(III)的策略因其通过选择性配位与三个半胱氨酸残基结合来提高肽的稳定性和结合亲和力而受到关注，但仍依赖外部金属盐，并且配位键的动力学不稳定性在复杂环境中可能面临一定挑战。巯基–烯烃光点击化学（Thiol-Ene Photoclick Chemistry）策略结合了点击化学的核心优点——快速、高效和操作简便，同时具备光激活的独特特性，能够精确调控反应的空间和时间。这些独到的特性使其在双环肽、噬菌体展示双环肽文库的构建和疾病靶标活性环肽筛选中发挥了关键作用。

图1. 环肽双环化策略（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者首先利用TAIC和N-乙酰基-L-半胱氨酸酯作为模型底物，通过一系列条件优化，确定了最佳反应条件，并将其拓展到线性多肽的双环化上。该反应能够在不同pH条件及不同缓冲盐溶液中有效进行，与传统的TBMB环化方法相比，巯基–烯烃光点击化学的环化策略更为高效，仅产生少量由连接子及光引发剂引起的杂质。此外，作者还将此策略拓展至一系列无保护的线性多肽肽链，验证了该环化策略在简便性和稳健性方面的优越性。

图2. 模型肽上的环化（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

图3. 环化底物拓展（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

随后，作者将这一方法应用于噬菌体展示相关实验中。首先，通过MALDI-TOF MS验证了在表达的融合pIII蛋白上进行的环化反应的可靠性。接着，构建了一个包含十个随机氨基酸（CX5CX5C）的噬菌体展示线性肽文库，并利用巯基–烯烃光点击化学进行了环化。针对疾病相关靶标蛋白CypA，作者进行了多轮淘洗，最终通过二代测序得到了富集的多肽序列。随后，利用表面等离子共振（SPR）和生物膜层干涉（BLI）技术，对富集的两条线性多肽及其环肽的亲和力进行了测定。结果表明，环肽CM1相比线肽M1，具有显著提高的结合亲和力，达到364 ± 70 nM，并且展现了较好的稳定性，半衰期为463分钟。为了进一步探究CM1与CypA的相互作用，作者使用了15N标记的CypA进行1H-15N-HSQC NMR滴定实验，结果显示CM1结合于CypA的活性口袋。这些结果突出了巯基–烯烃光点击化学构建的双环肽在高效且选择性靶向治疗相关蛋白方面的潜力。

图4. 巯基–烯烃光点击化学的应用（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

总结

本研究首次报道了光化学策略应用于自由肽和噬菌体展示无保护肽的双环化。与传统的TBMB介导的烷基化方法相比，巯基–烯烃光点击化学方法在效率、选择性和控制性方面具有显著优势，同时能最小化筛选过程中的假阳性。该方法操作简便、可扩展，并且与生物系统兼容，使其成为生成多样化肽库和发现挑战性蛋白靶标及蛋白–蛋白相互作用（PPIs）配体的有力平台。总体而言，本研究突显了巯基–烯烃光点击化学在扩展多肽药物化学生物学工具箱方面的巨大潜力。

相关工作发表在

Angewandte Chemie International Edition

（欢迎加入雷新响教授课题组攻读硕士、博士研究生或者从事博士后课题合作探索。平台拥有完善的分子生物学技术条件、有机合成设施及800 MHz核磁共振，岛津MALDI-TOF（7090）等实验条件。请有意者发送简历和研究小结至leixx@lzu.edu.cn。）

作者简介

通讯作者 雷新响

雷新响，男，博士生导师，药物化学专业，博士，现为兰州大学萃英特聘三级教授。毕业于中国科学院成都生物研究所，曾于2010-2011年在耶鲁大学从事mRNA与蛋白质相互作用研究工作。曾任中南民族大学药学院副院长和民族药学国家级实验教学示范中心主任。从事基于核磁共振波谱技术的药物分析、天然产物结构鉴定、活性筛选等研究工作。现讲授波谱分析，曾讲授化学生物学、生物化学、结构生物学、药事管理学等课程，主持国家自然科学基金面上项目及国际合作等项目。以通讯作者或第一作者在JACS，《德国应用化学》，《核酸研究》，ACS Nano，ACS Catalysis，Chemical Science，Analytical Chemistry，Organic Letters，Chemical Communication,《欧洲化学》，《磁共振化学》等期刊上发表系列SCI论文。任《Natural Products and Bioprospecting》编委；《Magnetic Resonance Letters》编委。现任中国化学会有机分析专业委员会委员，湖北省药学会理事，湖北省晶体学会理事，组织了多次国际学术会议，在全国性和国际性学术会议上做报告40余次，被Nature，德国应用化学，Nature Communications等期刊邀请为审稿人。

第一作者

明巍 兰州大学 博士研究生 药物化学生物学方向

杨小琴 兰州大学 博士研究生 药物化学生物学方向