《食品科学》：南京师范大学杨瑶副教授：基于CRISPR/Cas9技术的植物乳植杆菌YZH81 胞外多糖合成基因

乳酸菌是一类通过发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌。胞外多糖（EPS）是乳酸菌重要的次级代谢产物，安全无毒，表现出良好的热稳定性、保水性和凝乳能力等加工性能，在食品生产特别是乳品加工中发挥重要作用。

乳酸菌EPS合成基因簇的研究是探究乳酸菌EPS生物合成的基础。植物乳植杆菌EPS合成基因簇命名为荚膜多糖合成（cps）基因簇，具有多样性。值得注意的是，本实验室前期研究筛选到一株高产EPS的植物乳植杆菌YZH81，对其全基因组测序及cps分析显示该菌株有两个cps（cps1和cps2），其中cps1是未见报道的具有新结构的cps，是研究EPS生物合成及其菌株特异性的良好材料。

鉴于上述结果，南京师范大学食品与制药工程学院的黄淑婷、孙娅西及杨瑶*将深入开展植物乳植杆菌YZH81菌株EPS合成基因簇研究，首先利用CRISPR/Cas9技术敲除YZH81 cps2基因簇，进一步明确cps1基因簇的功能。在此基础上，研究YZH81菌株两个cps基因簇相关性，为揭示该菌株高产EPS的分子机制奠定基础，也为以研究植物乳植杆菌为代表的产EPS乳酸菌菌株特异性建立有利条件。

1

YZH81菌株cps2基因簇结构与功能分析

YZH81菌株经全基因组测序（GenBank登录号：NZ_JAODTM010000007.1），其

cps2

基因簇结构比对结果如图1所示。

结果表明，

cps2

基因簇为典型的植物乳植杆菌

cps

基因簇，该基因簇内含10 个基因，由于其基因排列顺序、大小及蛋白相似性与模式菌株WCFS1菌株

cps4

基因簇（

cps4A

cps4J

）中的基因一一对应且高度相似（相似性为93.13%～99.85%），故将其命名为

cps2A

cps2J

。其中，

cps2A

cps2B

cps2C

为链长度调节基因

wzd

wze

wzh

的同源物；

cps2D

被预测编码UDP-

N

-乙酰葡萄糖胺-4-表异构酶；

cps2E

为启动糖基转移酶基因；

cps2F/2G/2I

为糖基转移酶基因，

cps2F/2G

是聚合酶同源物，

cps2I

是翻转酶同源物。利用NCBI的BLASTP数据库，本研究选取其他14 株植物乳植杆菌的同源

cps

簇构建系统发育树，结果如图2所示，YZH81菌株的

cps2

簇与JDM1菌株

cps4

簇具有最高同源性（蛋白相似性100%），与C410L1菌株

cps4

簇同源性较低（蛋白相似性97.93%）。

值得注意的是，YZH81

cps2

簇与之前报道的

cps1

簇的同源性很低，蛋白相似性仅有36.17%。可见YZH81菌株的

cps2

簇是植物乳植杆菌具有代表性的

cps

簇，和

cps1

簇一起分别是YZH81菌株较为独立的两个不同

cps

簇。

2

YZH81菌株cps2基因簇缺失菌的构建

依照1.3.1节的方法，成功构建了YZH81菌株cps2基因簇敲除质粒pSH02

Δcps2

，图谱如图3a所示。其中 ，lp2099和lp2108分别是菌 株YZH81的

cps2

簇上、下游两端的同源臂片段，sgRNA包含特异性识别位点spacer序列，

P

11

为强启动子。

利用CRSIPR/Cas9技术通过敲除质粒pSH02Δcps2敲除YZH81菌株

cps

基因簇的原理如图3b所示。利用引物CPS4S-F2和CPS4X-R2进行阳性转化子的PCR验证，凝胶电泳图如图3c所示，1泳道在2 kb处有清晰条带，与同源臂连接片段大小一致；81-4S-F与81-4S-R、81-4X-F与81-4X-R分别为上游、下游同源臂引物，2、8泳道在1 kb处有清晰条带，与上下同源臂片段大小一致；81-4-1F/2F/3F/4F/5F与81-4-1R/2R/3R/4R/5R为中间片段验证引物，3～7泳道无条带，说明 cps2 基因簇片段已经敲除完全。成功构建的YZH81菌株 cps2 基因簇缺失突变株命名为YZH81

cps2 。

3

YZH81与不同cps基因簇突变菌的生长曲线

果蔬根据文中介绍的方法，绘制YZH81、YZH81

cps1 和YZH81

cps2 的36 h生长曲线， 如图4所示 。

从OD600 nm数值来看，YZH81、YZH81Δcps1与YZH81Δcps2生长曲线趋势较为一致，4～16 h为指数期，16 h左右达到稳定期，OD600 nm稳定在6.5左右。YZH81菌株及其两个cps突变株在对数期的生长量存在差别，其中YZH81的生长量最高，其次是YZH81

cps2 ，最后是YZH81

cps1 ，但3 个菌株到达稳定期之后生长趋于一致，直至发酵36 h后OD600 nm并无显著差异（ P ＞0.05）。从发酵液pH值来看，3 个菌株在稳定期前发酵液pH值有所差别，其中YZH81Δcps1菌株发酵液pH值下降较为缓慢，与其生长量缓慢的结果相一致，在稳定期之后，3 个菌株发酵液pH值持续稳定在3.7左右，无显著性差异（ P ＞0.05）。综合上述结果，推测敲除 cps1 或 cps2 基因簇可能影响了某些碳水化合物的合成与利用速度，但后期通过其他途径的替代或补充，最终并没有影响菌株的生长。

4

YZH81与cps基因簇突变菌EPS化学组成差异分析

1 EPS产量

木质素是根据文中介绍的方法，YZH81、YZH81

cps1和YZH81

cps2各菌株EPS提取结果如表3所示 。

野生型菌株YZH81的EPS产量为108.40 mg/L，突变型菌株YZH81Δcps1和YZH81Δcps2的EPS产量分别为83.60 mg/L和70.00 mg/L，与YZH81相比分别下降了22.88%和35.42%。结果显示，完整敲除单一基因簇的YZH81Δcps1和YZH81Δcps2菌株均具备独立生产EPS的能力，该结果充分说明了YZH81菌株cps1和cps2基因簇的独立性。然而，突变菌株EPS产量均低于野生型菌株，也进一步明确了YZH81菌株含有两个EPS合成基因簇，两个cps基因簇共同完成菌株的EPS合成。

2 EPS的单糖组成分析

PAL根据1.3.4节的方法对YZH81、YZH81

cps1 和YZH81

cps2 菌株EPS粗提物进行单糖组成分析，结果见表3。YZH81的EPS单糖占比从高到低依次为Rha（50.76%）、Glc（32.21%）、Gal（9.20%）和Man（7.83%）。YZH81

cps1 的EPS单糖组成有所不同，占比从高到低依次为57.71% Glc、37.33% Man和4.96% Gal，未检出Rha。YZH81

cps2 的EPS单糖组成与YZH81

cps1 类似，占比从高到低为64.74% Glc、29.48% Man和5.78% Gal，也未检出Rha。上述结果可知，敲除 cps1 和 cps2 显著影响了YZH81菌株EPS的化学组成，合成的EPS中占比最大的Rha组分消失，而Man和Glc组分则大幅提高。该结果与模式菌株WCFS1菌株 cps 簇缺失的结果不一致，WCFS1菌株 cps 1～4簇的缺失突变株只有WCFS1

cps1 菌株EPS单糖组分缺失了Rha，而其余 cps 簇缺失突变株EPS单糖组分则没有明显变化。

3 EPS的甲基化分析

根据文中的方法，YZH81、YZH81

cps1 和YZH81

cps2 的EPS单糖甲基化产物经过GC-MS分析，并根据CCRC数据库 （https://www.ccrc.uga.edulspecdb/ms/pmaa/pframe）分析得出产物的糖残基连接方式，得到结果对比图，如图5所示。

甲基化分析结果为，YZH81主要醛糖残基包括T-Manp、2-Galp、6-Manp、6-Glcp、2,3-Galp和3,4-Rhap，其中2,3-Galp和3,4-Rhap为侧链。YZH81

cps1 和YZH81

cps2 醛糖残基一致，包括T-Man p 、6-Man p 、6-Glc p 和2,3-Gal p ，其中2,3-Gal p 为侧链。结果说明其甲基化产物与单糖组成成分相对应，同时也验证了EPS单糖组成分析正确。

5

YZH81与不同cps基因簇突变菌蛋白组分析

5.1 蛋白组差异分析

将YZH81、YZH81

cps1 和YZH81

cps2 菌株分别发酵10 h和32 h，提取菌体总蛋白做蛋白质组分析。10 h菌株发酵液样品中，YZH81 10 vs YZH81

cps 1 10 表达量差异蛋白共395 个，其中显著性差异蛋白61 个（表达量上调蛋白26 个、下调蛋白35 个）。YZH81 10 vs YZH81

cps 2 10 表达量差异蛋白共395 个，其中显著性差异蛋白51 个（表达量上调蛋白31 个、下调蛋白20 个）。32 h菌株发酵液样品中，YZH81 32 vs YZH81

cps 132 表达量差异蛋白共391 个，其中显著差异蛋白99 个（表达量上调蛋白42 个、下调蛋白57 个）。YZH81 32 vs YZH81

cps 2 32 表达量差异蛋白共391 个，其中显著差异蛋白110 个（上调蛋白34 个、下调蛋白76 个）。该结果表明，从差异蛋白的数量上分析，发酵时间越长，受 cps 簇影响的菌体蛋白表达差异越大，且 cps2 簇缺失引起的蛋白差异更大。

比对YZH8110 vs YZH81

cps 1 10 与YZH8132 vs YZH81

cps 1 32 ，检索出共同差异蛋白29 个（图6a），比对YZH81 10 vs YZH81

cps 2 10 与YZH81 32 vs YZH81

cps 2 32 ，检索出共同差异蛋白22 个（图6b），将以上两组差异蛋白做GO和KEGG功能性分析。

5.2 GO功能注释分析

如图7所示，YZH8110&32 vs YZH81

cps 1 1 0&32 差异蛋白的GO功能集中在3 个一级类别，分别为生物学功能、细胞组成和分子功能，进一步可细分为17 个二级功能类别。在一级类别生物学过程的8 个二级类别中，有30.61%的差异蛋白被注释到代谢过程中，此外，被注释到细胞过程成、单组织过程的差异蛋白数量也较大（占比分别为26.53%和22.45%）。在一级类别细胞组成和分子功能中差异蛋白分别对应5 个和4 个二级类别。与敲除cps1相类似，如图7所示，YZH81 10&32 vs YZH81

cps 2 10&32 差异蛋白也集中在同样3 个一级类别中，进一步可细分为19 个二级功能类别。其中，一级类别生物学功能含9 个二级类别，差异蛋白功能注释占比较高的二级分类为代谢过程（31.37%）、细胞过程（25.49%）、单组织过程（23.53%）。与敲除 cps 1不同的是，敲除 cps 2的差异蛋白增加了发育过程、电子载体蛋白、转运相关蛋白和细胞器4 个二级类别，减少了核酸结合转录因子活性、类核2 个二级类别。该结果从蛋白功能的角度也说明了 cps 2簇缺失引起的菌体蛋白差异更大。

5.3 KEGG代谢通路分析

如图8所示，YZH8110&32 vs YZH81

cps 1 10&32 菌体差异蛋白集中在4 个一级分类，为新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程。其中，77.78%差异蛋白KEGG代谢通路注释为新陈代谢，这一大类主要分支为全局图和概览图（47.62%），其次是其他氨基酸的代谢（19.05%）、辅助因子和维生素的代谢（14.29%）、氨基酸代谢（14.29%）、碳水化合物代谢代谢（4.76%）。如图8所示，YZH81 10&32 vs YZH81

cps2 10&32 菌体差异蛋白集中在3 个一级分类，其中，新陈代谢一级分类占比80%，包括全局图和概览图（45%）、氨基酸代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢和其他氨基酸的代谢（各10%）、辅助因子和维生素的代谢、核苷酸代谢、肽聚糖的生物合成与代谢（各5%）。值得注意的是，与敲除 cps 1簇情况相比，敲除 cps 2簇引起的差异蛋白注释的功能更多，新陈代谢一级分类中增加脂质代谢、核苷酸代谢和肽聚糖的生物合成与代谢3 个二级分类，环境信息一级分类中增加了跨膜运输1 个二级分类。该结果显示相比GO功能注释分析，KEGG代谢通路分析更充分显示 cps 2簇缺失引起的菌体蛋白功能差异更大。

6

乳酸菌EPS作为一种具有独特理化性质和生物活性的天然产物，在食品、医药等领域具有广泛的应用前景，而EPS合成基因簇是研究EPS构效关系的物质基础。本研究前期针对实验室保藏的一株高产EPS的植物乳植杆菌YZH81开展EPS合成基因簇研究，发现其基因组上有两个cps簇（cps1和cps2），其中cps1与已知cps簇结构相差较大。利用Cre-loxP同源重组技术敲除cps1后，突变株YZH81

cps1 的EPS显著下降，然而，相同方案敲除 cps2 却一直未成功。因此，本研究选择CRISPR/Cas9技术首先敲除YZH81菌株 cps2 基因簇，为进一步研究YZH81菌株的EPS合成奠定基础。

目前，CRISPR/Cas9技术在乳酸菌上的应用逐渐增多，如Yang Xiangke等基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统敲除葡萄酒乳酸菌的柠檬酸盐转运蛋白基因JKL54_04345(citP)，验证该基因在柠檬酸盐代谢中的作用；Tian Xiwei等通过CRISPR/Cas9方法敲除副干酪乳杆菌ldhD基因，并引入ldhL1基因，获得了高产L-乳酸的菌株；Wang Guangqiang等通过CRISPR/Cas9技术，以植物乳植杆菌AR113为研究菌株，构建了单、双和三重bsh基因敲除菌株，研究bsh抗胆汁盐的机制。但现有报道都针对1 kb左右基因的编辑，对于实现大片段的基因敲除仍然是一个挑战。本研究中YZH81菌株的cps2基因簇共9.7 kb，含10 个基因。实验过程中在同源臂长度、sgRNA序列选择等方面均做了不同尝试，最终构建了pSH02-81Δcps2质粒，成功实现了cps2完整基因簇的敲除。本研究中筛选了pSH02Δcps2质粒转化的阳性克隆60 个，经PCR验证，部分敲除cps2基因簇的克隆数5 个，完整敲除cps2基因簇的克隆数1 个，可见CRSIPR/Cas9技术用于大片段基因敲除虽具有一定难度，成功率1.67%，与现有报道25%～100%相比，成功率较低。但是，相比于实验室前期尝试的Cre-loxP策略，CRISPR/Cas9技术仍旧具有优势。

利用CRISPR/Cas9技术成功构建了YZH81Δcps2菌株之后，开展了YZH81及其两个cps簇敲除突变株的EPS特性研究。结果显示YZH81Δcps1和YZH81Δcps2的EPS产量分别为83.60 mg/L和70.00 mg/L，与野生型YZH81相比分别下降了22.88%和35.42%，该结果明确了cps1和cps2均是具有独立合成EPS能力的基因簇，而由于cps1簇的基因排列与现有植物乳植杆菌cps簇均不相同，故本研究确立了YZH81菌株的cps1基因簇是植物乳植杆菌cps簇的一种新类型。

为了研究两个不同cps簇对YZH81菌株合成EPS的构效关系，本研究随即开展了YZH81菌株及两个cps簇缺失突变株所产EPS的化学结构分析。已有报道显示植物乳植杆菌杆菌来源的EPS化学组成具有多样性，如模式菌株WCFS1菌株EPS单糖组成有Glc、半乳糖醛酸、Gal、Rha和葡萄糖胺5 种，含量最高的半乳糖醛酸占比45.66%，Glc次之为22.78%。又如YC菌株EPS单糖组成含Man、阿拉伯糖、岩藻糖、核糖、葡萄糖醛酸等9 种，而BC-25菌株EPS的单糖组成较为简单，只有Glc、Man和Gal 3 种，但其中Man占比最大，达到92.21%。相比之下，YZH81菌株EPS单糖组成也较为简单，含有4 种单糖，但与已有报道不同的是，Rha成分占比最大（50.76%）。有趣的是，分别敲除了cps1和cps2基因簇之后，突变株YZH81Δcps1和YZH81Δcps2的EPS均缺失了占比最大的Rha组分，转而Man和Glc组分含量则大幅提高。该结果首先验证了YZH81菌株的两个cps簇在EPS合成中的独立性，即缺失任何一个cps簇对菌株合成的EPS结构影响都非常显著。此外，该结果也为未来从化学结构层面对EPS开展从头合成提供了思路。

近年来针对乳酸菌EPS的研究不断升温与其潜在的益生功效密不可分。本研究利用蛋白质组学分析了两个不同cps簇相比于野生型YZH81菌株的差异蛋白。先后制备了发酵10 h和32 h的cps簇缺失突变株和野生型菌株总蛋白，经蛋白质组分析比对，检索出由cps1缺失引起的差异蛋白29 个（图6a）和cps2缺失引起的差异蛋白22 个（图6b），将差异蛋白作GO和KEGG功能性分析，结果显示cps1和cps2簇的相同之处是参与YZH81菌株的生物学功能、细胞组成，该结果与cps簇合成EPS的功能性相一致。不同的是，在GO注释分析中，敲除cps2的差异蛋白相比于敲除cps1的差异蛋白增加了发育过程、电子载体蛋白、转运相关蛋白和细胞器4 个二级类别，减少了核酸结合转录因子活性、类核2 个二级类别，而在KEGG代谢通路分析中，敲除cps2簇引起的差异蛋白注释的功能也更为丰富，新陈代谢一级分类中增加脂质代谢、核苷酸代谢和肽聚糖的生物合成与代谢3 个二级分类，环境信息一级分类中增加了跨膜运输1 个二级分类。以上结果揭示了YZH81菌株的两个不同cps簇分别承担了不同功能，为本实验室进一步开展YZH81菌株的EPS益生性功能试验奠定了理论基础。

7

结论

本实验针对实验室筛选的植物乳植杆菌YZH81独特的EPS合成基因簇的结构，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了cps2簇缺失突变株YZH81Δcps2。与野生型YZH81菌株相比，YZH81Δcps2的EPS产量显著降低（下降了35.42%），且EPS单糖组成中未检出Rha，其他各单糖组分比例也有很大差异。蛋白质组分析结果显示，敲除cps2簇引起的差异蛋白功能集中在脂质代谢、核苷酸代谢、肽聚糖的生物合成与代谢及跨膜运输等方面。综上，本文研究了cps2基因簇与EPS合成相关的功能，为进一步探究植物乳植杆菌EPS生物合成机制建立了有利条件。

本文《基于CRISPR/Cas9技术的植物乳植杆菌YZH81胞外多糖合成基因簇功能鉴定》来源于《食品科学》2025年46卷第6期133-141页，作者：黄淑婷，孙娅西，宦海琳，贾思思，赵 芳，吕广萍，杨 瑶*，陈金印。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240814-104。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：闫凯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网