13价肺炎球菌多糖结合疫苗免疫原性的小鼠模型评价

中文摘要

目的通过比较13价肺炎球菌多糖结合疫苗在BALB/c、KM、CD1小鼠品系体内的免疫应答，评价该疫苗的最佳小鼠免疫原性模型及此模型的最佳小鼠性别及免疫剂量。

方法将13价肺炎球菌多糖结合疫苗分别以每针次0.05、0.10、0.20、0.40 μg的剂量免疫3个品系小鼠，采用ELISA分析免疫应答差异以评价最佳小鼠模型；比较4个剂量在最佳小鼠模型中的雌雄小鼠应答差异以评价最佳小鼠性别；比较4个剂量免疫最佳性别的最佳小鼠模型以评价最佳免疫剂量。

结果3个品系中，多数血清型在CD1小鼠中免疫应答值最高，KM小鼠应答最弱。在CD1小鼠品系中剂量与免疫应答之间有明显量效关系。4个剂量免疫CD1雌雄小鼠，0.05 μg剂量时免疫应答值均较低，在0.10、0.20、0.40 μg剂量时，几乎所有血清型在雌性小鼠中产生的免疫应答值均高于雄性小鼠。4个剂量免疫CD1雌性小鼠，除3、9V、19F、23F型外，其余血清型在0.20 μg剂量产生的免疫应答值均明显高于其他3个剂量。

结论评价13价肺炎球菌多糖结合疫苗免疫原性的最佳小鼠模型为雌性CD1小鼠， 最佳免疫剂量为0.20 μg。

正文

肺炎链球菌是革兰阳性菌，感染后能引起一系列非侵袭性和侵袭性疾病，在儿童中发病率和致死率高 。目前，与肺炎疾病相关的肺炎球菌血清型有100多种。多糖蛋白结合疫苗在减少侵袭性肺炎球菌相关疾病的发病率方面发挥关键作用。2010—2019年在全球范围内，13价肺炎球菌结合疫苗避免了至少1.75亿例肺炎球菌相关疾病的发生和62万例5岁以下儿童因肺炎球菌感染引起的死亡。目前，肺炎疫苗的发展方向主要为更高价次的肺炎球菌结合疫苗、由新型载体制备的结合疫苗以及基于保守蛋白抗原的蛋白疫苗。

动物模型是疫苗非临床免疫原性、有效性确认的重要方式。评估肺炎疫苗安全性和有效性的动物模型很多，小鼠模型是其中的重要一员。肺炎疫苗通过不同免疫剂量免疫不同小鼠品系产生的免疫应答差异较大，对小鼠模型进行评估十分必要。由于尚无肺炎疫苗最佳小鼠模型筛选的相关报道，因此本研究用13价肺炎球菌多糖结合疫苗分别免疫BALB/c、CD1、KM品系小鼠，以评价疫苗的最佳小鼠模型及在此模型中疫苗免疫的最佳剂量及小鼠性别。

1

材料与方法

1.1

疫苗

13价肺炎球菌多糖结合疫苗由兰州生物制品研究所有限责任公司（兰州公司）菌苗四室制备，除6B型含量为4 μg/剂外，其余12个血清型含量均为2 μg/剂。

1.2

实验动物

3种品系的小鼠均为无特定病原体级，4周龄。BALB/c、KM小鼠由兰州公司实验动物室提供，CD1小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物生产许可证号：SCXK（甘）-2023-0001；动物使用许可证号：SYXK（甘）2023-0001；伦理批准文号：IACUC-LIBP-20240611。

1.3

主要试剂与仪器

肺炎球菌1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型共13个血清型荚膜多糖由兰州公司第一研究室提供，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG购自美国Southern Biotech公司；655080型酶标板购自德国Greiner公司，Spectra MAX190酶标仪购自美国Molecular Devices公司。

1.4

小鼠免疫及血清制备

（1）小鼠免疫剂量通常约为人用剂量的1/10，分别用1/40、1/20、1/10、1/5剂 13价肺炎球菌多糖结合疫苗或0.025 mg磷酸铝佐剂（对照）皮下免疫BALB/c、CD1、KM小鼠，每组20只（雌雄各10只）。（2）分别以上述4个剂量的疫苗或0.025 mg佐剂（对照）免疫筛选出的最佳品系的雌性和雄性小鼠，每组10只。（3）分别以上述4个剂量的疫苗或0.025 mg佐剂（对照）皮下免疫筛选出的最佳品系最佳性别的小鼠，每组10只。

上述每组小鼠共免疫3针次，各间隔14 d，第3针免疫后14 d眼球采血，于37 ℃放置1 h后离心，收集血清，置于-20 ℃待用。

1.5

血清IgG抗体水平测定

用间接ELISA测定小鼠血清中各型特异性IgG抗体的含量。

1.6

统计分析

采用Softmax软件提供的四参数拟合法分析数据，阳性血清（由第3针鼠血清制成）IgG抗体水平为800 ELISA单位/mL，应用分析模板计算各样品的IgG抗体水平，并计算每组抗体水平的几何平均值。免疫原性的比较采用GraphPad Prism 8.0软件，通过t检验计算P值，以P<0.05为差异有统计学意义。

2

结果

2.1

不同剂量免疫小鼠产生的免疫应答比较

如图1所示，以每针1/40、1/20、1/10、1/5剂 13价肺炎球菌多糖结合疫苗分别免疫BALB/c、KM、CD1小鼠3针后，不同品系小鼠对13个血清型均能产生不同程度的免疫应答，且比对照组均有10倍以上的升高。

在3种品系中，CD1小鼠对多数血清型免疫应答最高。以1/40剂免疫时，3种品系小鼠对13个血清型产生的免疫应答均较弱，品系间差异不明显；以1/20剂免疫时，CD1小鼠对13个血清型的免疫应答值均明显高于BALB/c和KM小鼠；以1/10剂免疫时，除19F型外，CD1小鼠对其余型别的免疫应答均明显高于BALB/c和KM小鼠；以1/5剂免疫时，除6A型外，CD1小鼠对其余型别的免疫应答值均高于BALB/c和KM小鼠。

随着免疫剂量的提高，CD1小鼠免疫应答逐渐增强，1/5剂时下降。即CD1品系在1/40~1/5剂间有明显的量效关系。其他2个品系均没有明显的量效关系。

2.2

CD1小鼠雌雄性别免疫差异

以1/40、1/20、1/10、1/5剂13价肺炎球菌多糖结合疫苗分别免疫CD1雌性和雄性小鼠，产生的免疫应答见图2，差异统计值见表1。

（1）以1/40剂免疫时，产生的免疫应答值均较低，雌雄小鼠对13个型别产生的免疫应答差异不明显。

（2）以1/20剂免疫时，虽然各型雌雄应答的差异均没有统计学意义（P＞0.05），但雌性小鼠产生的免疫应答值均高于雄性小鼠。

（3）以1/10剂免疫时，雌性小鼠产生的免疫应答值均明显高于雄性小鼠，其中对1、5、7F、14、19A型的应答雌雄差异具有统计学意义。

（4）以1/5剂免疫时，除19F外，雌性小鼠对其余12个血清型产生的免疫应答值均高于雄性小鼠，且除5、6B、9V、19F型外，其余9个血清型雌雄应答的差异均具有统计学意义。

通过对比4个免疫剂量下CD1雌雄小鼠对13个型别的免疫应答，可以看出雌性小鼠产生的免疫应答高于雄性小鼠。

2.3

CD1小鼠免疫剂量差异

分别以每针1/40、1/20、1/10、1/5剂13价肺炎球菌多糖结合疫苗免疫CD1雌性小鼠（每组10只），对13个血清型的免疫应答情况如图3所示。

由图3可见，以每针1/40剂免疫CD1雌性小鼠，小鼠体内产生的针对13个型别的免疫应答值均较低；随着免疫剂量的升高，小鼠的免疫应答逐渐增强。对比4个剂量下对13个血清型产生的免疫应答值，除3、9V、19F、23F型外，1/10剂产生的对其余血清型免疫应答均高于另外3个剂量。

3

由于疫苗在不同小鼠品系中产生的特异性免疫应答的强度差异较大，因此疫苗免疫原性模型的建立对于评价疫苗的有效性十分重要。同时，疫苗免疫应答强度还会随着免疫剂量、动物性别的不同而产生差异。

本研究选择了肺炎结合疫苗临床前免疫评价常用的2个小鼠品系（CD1、BALB/c小鼠）和1个国内用量最多、用途最广的品系（KM小鼠）。其中，CD1、KM小鼠属于远交系，BALB/c小鼠属于近交系。近交系和远交系动物各自有其优缺点。从遗传学的角度，对于大多哺乳动物，近交系在遗传变异方面有高度同源性，远交系小鼠能更好地模拟人类遗传学多样性，更推荐应用远交系小鼠评价疫苗的有效性。从免疫学角度，不同品系的远交系小鼠对不同种类疫苗的免疫应答敏感性也有着较大的差异。虽然KM小鼠是国内用量最多、用途最广的远交品系，但其对13价肺炎球菌结合疫苗的应答并不敏感。

从小鼠品系筛选的结果来看，3种品系中，CD1小鼠对除19F型和6A型外其余血清型免疫应答值均最高。对19F型，在1/10剂时比BALB/c小鼠虽略低，但应答数值差异很小，图1中也可以看到应答值的点是相交的，在1/20和1/5剂时CD1小鼠的应答值仍然比其他2个品系高。1/5剂时CD1小鼠对6A型应答虽略有下降，但在此剂量下与BALB/c小鼠相比应答数值差异也很小，图1中也可以看到应答值的点是相交的。这并不影响品系筛选结果的判断：整体而言CD1品系是最优的。

本研究在确定了CD1品系作为13价肺炎球菌多糖结合疫苗的免疫原性评价模型后，评价了该疫苗免疫CD1小鼠的最佳小鼠性别及免疫剂量。

雌性小鼠在小鼠免疫时更易控制，且结合疫苗免疫雌性小鼠产生的抗体水平明显高于雄性小鼠，这在其他研究中已有发现。本研究也得到了相同的结论，雌性小鼠产生的免疫应答值明显高于雄性小鼠。说明13价肺炎球菌多糖结合疫苗免疫CD1小鼠时，优选雌性小鼠。

通过比较不同免疫剂量在CD1雌性小鼠中的应答值可以看出，对除19F、23F、3、9V型外其余9个血清型免疫应答随着免疫剂量的升高而增强，1/10剂产生的免疫应答值均最高，在1/5剂产生的免疫应答值均下降。这是因为随着免疫剂量的提高，载体蛋白质的含量逐渐累积，在1/5剂时对各型多糖的免疫效果产生了免疫抑制作用（即载体诱导的表位抑制），导致免疫应答水平下降，这种免疫抑制现象在人体和动物体内都有相关文献报道。对于19F、23F、3、9V型，产生免疫抑制的剂量并不相同。对于3和9V型，虽然1/5剂比1/10剂产生的免疫应答略有升高，但从应答值及曲线趋势看未产生明显的升高趋势，说明在CD1小鼠体内这2个型别产生的免疫抑制作用并不明显。19F型在CD1小鼠体内产生的免疫抑制作用随剂量的升高更明显，在1/20剂时就已经产生了免疫抑制作用，增加剂量免疫抑制作用逐渐增强。对于23F型，随免疫剂量的增加免疫应答逐渐增强，在1/5剂应答值最高，免疫抑制作用在23F型中表现并不敏感。由于13价肺炎球菌多糖结合疫苗是由13个型别单价原液按相同含量（6B型加倍）混合制备而成，因此最佳免疫剂量的选择无法兼顾所有的型别。考虑到大多数型别在1/10剂免疫应答最高，仅4个型别在1/10剂免疫应答为仅次于其最优剂量的应答，选择1/10剂为13价肺炎球菌多糖结合疫苗对小鼠的最佳免疫剂量。

13个型别免疫剂量的趋势分析结果提示，在多价肺炎结合疫苗研发过程中，不能仅通过提高免疫剂量来改善某个型别免疫原性弱的问题，而是需要对工艺进行优化（如结合方法、载体蛋白质选择、结合参数等）。

本研究通过比较13价肺炎球菌结合疫苗在3种品系小鼠内的免疫原性差异，建立了该疫苗的小鼠免疫原性评价模型，能够在临床前研究中为该疫苗在动物模型中的免疫原性和疫苗组分有效性评价提供参考。

鉴于CD1品系对于肺炎球菌疫苗的免疫应答的敏感性更高，产生的免疫应答更强，本研究建立的13价肺炎球菌多糖结合疫苗小鼠模型可适用于更高价次的肺炎结合疫苗。由于价次进一步升高，载体介导的表位抑制作用在新增型别中的趋势不一定相同，因此此小鼠模型在用于更高价次肺炎结合疫苗时，需要对最佳免疫剂量重新进行研究。

作者

杨英英 杨钰娟 祁鹏宇 杨晨 周宇晨 钱文君 苏文婷 杨田瑶 周海飞 罗树权

兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗四室，甘肃省疫苗技术创新中心，兰州 730046

通信作者：周海飞，

Email：haifeichow@163.com

引用本文：杨英英, 杨钰娟, 祁鹏宇, 等.13价肺炎球菌多糖结合疫苗免疫原性的小鼠模型评价[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(5): 315-320.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20250107-00001

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