APPS | 优化TRIzol-硅胶柱法提取DSS结肠炎模型RNA：解决PCR抑制问题

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Introduction

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的临床表现，其特征是慢性特发性炎症局限于结肠黏膜，其发病机制尚不完全阐明。近年来，在阐明UC的致病机制和开发治疗干预方面取得了重大进展，这在很大程度上得益于各种实验模型的应用。TNF-α和IL-6都是促炎细胞因子中的关键介质，它们与IBD的发病机制广泛相关，主要是通过它们能够放大粘膜炎症和损害上皮屏障完整性。针对促炎细胞因子的治疗干预已被证明可以减轻肠道病变；此外，TNF-α和IL-6在推动疾病进展方面的协同相互作用进一步支持了它们作为IBD管理的双重治疗靶点的候选资格。

葡聚糖硫酸钠（DSS）最初由Okayasu等于1990年引入，现已成为诱导实验性结肠炎的最广泛使用的化学试剂之一。在3～5个周期内重复口服DSS可可靠地诱发小鼠慢性复发性结肠炎，其特征是体重进行性减轻和结肠长度显著缩短。该模型在炎症性病变的发展中具有很高的可重复性和均匀性，特别是在远端结肠内，从而为研究结肠炎的病理生理机制和评估治疗干预措施提供了强大的平台。DSS，特别是分子量为40 kDa的DSS，已被证明在口服给药后穿过肠粘膜屏障并在各种组织中积累。DSS在暴露后24 h内定位于结肠巨噬细胞、肠系膜淋巴结和肝脏Kupffer细胞。到第3天，可以在脾脏巨噬细胞中检测到DSS，反映全身播散。

定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种广泛采用的技术，用于评估DSS诱导的结肠炎模型中促炎细胞因子的表达。然而，该方法的准确性和可重复性可能会受到与DSS相关的干扰的严重影响。先前的研究表明，DSS对逆转录酶和Taq聚合酶活性均具有剂量依赖性抑制作用，而Tween 20等非离子表面活性剂的加入无法减轻这种抑制作用，从而使DSS处理组织中的下游qPCR分析复杂化。因此，确定一种可靠、经济高效且直接的方法来减轻DSS介导的抑制对于提高该模型中基因表达研究的准确性具有相当重要的意义。

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PCR：在评估加工食品和人类健康中的概述和应用

PCR是一种重要的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA序列，使研究人员能够精确有效地检测和分析遗传物质。该反应需要DNA模板、序列特异性引物、脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dTTP、dCTP和dGTP）、缓冲反应环境和耐热DNA聚合酶（最常见的是Taq聚合酶。DNA合成沿5'至3'方向进行，酶通过沿模板链掺入互补的dNTP来延伸引物。qPCR是一种通过靶序列的指数扩增来定量核酸的高灵敏度方法。该过程涉及循环变性、引物退火和Taq聚合酶延伸，从而能够通过基于荧光的探针或染料进行实时检测。

PCR已成为食品安全和质量控制中不可或缺的工具，通过扩增物种特异性核酸序列，可以快速、灵敏和特异性地检测主要食源性病原体，如沙门氏菌属、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7。这些分子技术能够及早识别和定量微生物污染物，从而支持法规遵从性和公共卫生保护。这加快了污染筛查，降低了消费者的风险，并支持法规遵从性。PCR还可以确保食品的真实性和可追溯性，从而检测肉类或鱼类产品中的意外物种，并识别食品欺诈或过敏原污染案例，以保护敏感个体。由于其速度、灵敏度和精度，PCR已成为食品生产质量控制不可或缺的一部分。它使食品公司能够监控制造过程的每个阶段，并有助于降低污染和代价高昂的召回风险。随着技术的不断进步，qPCR有望变得更加高效，进一步加强全球食品安全体系。

qPCR在人类健康和医学研究中也发挥着变革性作用。例如，高通量qPCR能够以极快的速度和准确度同时处理数千个样本，从而彻底改变了基因组分析。这种能力在群体遗传学、疾病监测和环境研究中特别有价值。集成到高通量系统中的自动化和机器人技术减少了体力劳动，提高了可重复性，并加快了结果，使复杂的遗传分析能够应用于更广泛的科学和临床领域。在生物安全和公共卫生领域，高通量qPCR在检测生物威胁方面发挥着关键作用，包括新出现的传染源（例如SARS-CoV-2、H1N1）和环境样本中的抗生素耐药基因，这凸显了其快速性和便携性，在疫情监测和大流行准备中具有重要价值。在临床诊断中，将传统的机器学习技术与基于qPCR的验证相结合，以发现胰腺癌的稳健治疗靶点，促进精准医疗和靶向治疗。特别是，qPCR被广泛应用于研究靶基因在炎症、代谢紊乱和微生物感染等生理和病理条件下的转录调控。这使其成为一种非常适合涉及细胞因子表达、生物标志物验证和通路分析的研究的方法。其高灵敏度和相对较低的RNA输入要求允许精确定量mRNA水平，即使在小或复杂的组织样本中也是如此，使其成为结肠炎模型或其他炎症相关研究中结肠组织分析的理想选择。

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IBD：基于qPCR的炎症评估的机制、DSS诱导模型和挑战

IBD包括UC和克罗恩病，是一种持续性、复发性疾病，其特征是胃肠道炎症，全球发病率不断上升。尽管进行了数十年的研究，但IBD的发病机制仍不完全清楚，目前尚无治愈性治疗方法，这进一步给公共卫生带来了沉重负担，导致生活质量下降、结直肠癌风险增加和大量医疗费用。因此，迫切需要研究IBD的潜在分子机制并开发更有效的诊断和治疗干预措施。为了研究免疫反应、肠道微生物群和肠上皮细胞在IBD发病机制中错综复杂的相互作用，研究人员经常依赖结肠炎动物模型，其中DSS诱导的小鼠结肠炎是最广泛使用的模型之一。

DSS诱发的结肠炎仍然是研究肠道炎症的最广泛使用和特征最充分的模型之一，因为它简单、可重复，并且能够模仿人类UC的几个关键特征。该模型是通过在饮用水中口服DSS启动的，这会导致结肠上皮屏障的剂量和持续时间依赖性损伤。这种上皮破坏使管腔抗原（包括微生物产物）能够穿透粘膜，从而引发强大而持续的免疫反应。因此，小鼠表现出结肠炎的临床和组织学症状，如体重减轻、腹泻、直肠出血、隐窝结构扭曲、粘膜溃疡和白细胞浸润。该模型因其快速诱导局部免疫反应而广受青睐，从而使研究人员能够研究肠道炎症的起始和消退阶段，这使其成为评估抗炎剂和阐明宿主对上皮损伤反应的宝贵平台。qPCR是评估DSS诱发的结肠炎炎症反应的核心方法，因为它可以准确定量与关键促炎细胞因子相对应的mRNA水平，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ，它们是免疫激活、上皮破坏和白细胞浸润的分子特征。qPCR因其灵敏度、特异性和成本效益而受到认可，仍然是一种广泛使用的技术，通常与组织病理学评估和免疫测定相结合，以产生粘膜炎症的全面概况。然而，最近引起关注的一个技术问题是残留的DSS对下游分子测定的潜在干扰，特别是qPCR。DSS由于其高硫酸盐含量和多阴离子性质，即使在提取后也可以在结肠组织中持续存在或与RNA样品保持相关性。值得注意的是，已知DSS会抑制对PCR至关重要的DNA聚合酶（如Taq），它们的残留存在可能会抑制逆转录或聚合酶活性，从而导致人为地降低或缺失扩增信号。DSS主要通过其高度硫酸化的多阴离子性质干扰qPCR，从而广泛抑制核酸扩增和细胞过程。它可以与聚（U）竞争并抑制核糖核酸酶活性，而类似的天然或合成聚阴离子聚合物会破坏mRNA-核糖体相互作用并调节翻译效率。这些综合效应通常表现为Ct值延迟、荧光信号减弱或完全扩增失败，最终破坏qPCR检测的灵敏度、准确性和可重复性。事实上，数据记录了DSS处理小鼠的结肠中qPCR信号受到抑制或检测不到，即使细胞因子水平预计会升高（图1），这种抑制可以通过阻止DNA扩增来干扰遗传分析，这对在IBD研究中依赖基于PCR的方法的研究人员构成了限制。这种抑制会阻止DNA扩增来干扰遗传分析，这对在IBD研究中依赖基于PCR的方法的研究人员构成限制。

图1 使用TRIzol提取法对DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织中TNF-α的Ct值

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克服DSS模型中传统RNA纯化方法的局限性：实现快速且经济高效的提取工作流程

DSS作为一种亲水性和强阴离子性聚合物，在RNA分离过程中倾向于与核酸共沉淀并共提取物。这种污染显著抑制逆转录酶和Taq聚合酶活性，从而抑制qPCR扩增效率。为了解决这个问题，额外的RNA纯化步骤对于提高RNA对下游应用的适用性至关重要。常见的方法包括双氯化锂（LiCl）沉淀法和精胺介导的多核苷酸激酶活性抑制。虽然LiCl沉淀可以有效去除DSS，但它通常涉及多个耗时的步骤，包括两轮高浓度LiCl沉淀（每轮需要在冰上孵育90 min以上）以及随后的异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程，总处理时间可超过4 h。此外，LiCl方法对初始RNA浓度的要求相对较高，并且回收效率容易发生变化。在延长的加工过程中，还需要格外小心，以防止RNA降解。尽管增加了动手时间和RNA丢失的风险，但由于其成本效益和在大多数实验室环境中的可及性，这种方法被广泛采用。

在DSS污染的情况下，精胺为恢复PCR和qPCR性能提供了实用有效的解决方案。它有效地中和了DSS对DNA聚合酶和逆转录酶活性的抑制作用，无需劳动密集型纯化步骤即可实现可靠的扩增，这使得精胺在涉及DSS诱导的结肠炎模型的工作流程中特别有利。尽管精胺能有效抵消DSS介导的抑制作用，但由于其有效范围窄，在较高浓度下存在扩增抑制的风险，以及与其他阴离子抑制剂的潜在相互作用，其机制尚不完全清楚，因此其应用需要精确优化。

一些研究建议在TRIzol裂解或酶处理后结合聚A纯化，以减轻残留的DSS干扰，尽管这些方法相对昂贵且程序复杂。专为DSS模型设计的商业RNA提取试剂盒（QIAGEN、RNeasy Mini试剂盒或Bio-Rad ）通常无需额外的纯化步骤，以加快RT-qPCR的RNA制备，从而显著缩短了整体提取时间，但需要更高的技术精度和严格的实验条件。此外，试剂盒组件的专有性限制了方案的灵活性，这促使我们开发了一种简化、快速和高效的RNA提取方法，专为高通量或重复样品处理量身定制。这些缺陷促使我们尝试构建一种更加简化、快速和高效的RNA提取方案，这在处理大量样本或重复实验时尤其有利。

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DSS模型中的RNA提取：挑战、常规局限性和在基于PCR的炎症评估中的应用

DSS是一种高分子量硫酸化多糖，往往会在组织样本中持续存在，从而干扰随后的RNA提取和纯化过程。DSS的分子结构特征是高度支化的多糖主链富含磺酸基团，赋予强烈的整体负电荷。同时，其分子骨架大且高度分支。这种结构特性使得DSS在水溶液中表现出很强的亲水性和电荷排斥性，阻碍了与二氧化硅基纯化基质的有效相互作用，使其无法被有效吸附或去除。相比之下，RNA中的核糖单元含有多个羟基，能够与二氧化硅表面形成稳定的氢键，从而实现选择性吸附。

本研究评估了一种优化的RNA提取方案，该方案将TRIzol试剂与基于硅胶柱的纯化相结合。所提出的方法有效地解决了分子分析中常见的主要局限性，包括成本高、处理时间长和RNA质量不一致。实验室广泛使用的商业RNA提取试剂盒（如QIAGEN、RNeasy Mini试剂盒或Bio-Rad ,326,820）的提取成本通常在3～7美元。在大规模研究下，试剂的累积成本可能会变得可观。相比之下，本研究开发的方案利用标准硅胶膜离心柱与碱性化学试剂（TRIzol、氯仿、异丙醇和乙醇）相结合进行RNA提取。这种适应将直接试剂成本降低到每个样品不到1美元，显著减轻了财务负担。这种具有成本效益的策略对于涉及高样品通量或长期多时间点采样设计的动物研究特别有利。

传统的RNA提取过程，特别是在处理由DSS诱导的结肠组织样本时，由于去除共提取的DSS残基，通常会引入额外的步骤。如果进行LiCl沉淀、反复洗涤或DNase处理等步骤，总提取时间将延长至4 h以上。硅胶膜柱在高盐/醇条件下通过氢键和脱水选择性地结合核酸，其中RNA的磷酸骨架和核糖羟基与表面硅醇相互作用。相比之下，DSS是一种多阴离子多糖，其高度水合的硫酸盐基团可防止有效的脱水和二氧化硅粘附。因此，在RNA纯化过程中，DSS在流通中被排除或被乙醇冲走，可能最大限度地减少其共洗脱和随后对qPCR的干扰。

在这项研究中，使用改进的基于TRIzol的提取方案结合二氧化硅离心柱纯化，从小鼠结肠组织的1 cm片段中分离出总RNA。将组织样品置于预装不锈钢珠的2 mL裂解基质管中，并使用组织裂解器（MP Biomedicals）在0.5 mL TRIzol试剂中均质化，直至实现完全组织破坏。随后，加入0.1 mL氯仿，将样品剧烈涡旋15 s，并在室温下孵育5 min。通过在4 °C下以11500 × g离心15 min来完成相分离。将透明上层水相小心地转移到新鲜的无RNase管中，并与等体积的2-丙醇混合，并在室温下孵育5～10 min。然后将混合物加载到二氧化硅离心柱上以促进RNA结合。在4 °C下以10000 × g离心3 min后，用75%乙醇洗涤色谱柱两次，并在4 °C下再次以10000 × g离心3 min以除去残留乙醇。通过以10000 × g离心3 min，将RNA洗脱在50 μL生物级水中（10000 × g，3 min）（图2）。使用NanoDrop分光光度计评估提取的RNA的纯度和浓度。从样品均质化到RNA回收的总提取时间仅需约1 h，显著缩短了作周期并提高了样品处理通量。同时，缩短的处理时间有效地降低了RNA降解的风险，考虑到接受DSS处理的组织中RNA固有的脆弱状态，这一点尤为关键。

图2 使用TRIzol试剂比较标准和优化的RNA提取工作流程

实验结果表明，DSS处理组的Ct值显著降低，表明RNA模板的可用性充足，并表明这种优化的提取方法有效地减轻了DSS诱导的PCR反应抑制（图3）。此外，DSS治疗显著上调促炎细胞因子（TNF-α）的表达（图3），这与预期的炎症反应一致，并进一步支持提取的RNA在下游分子分析中的可靠性。

图3 使用优化的TRIzol-硅胶柱提取方法，DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织中TNF-α的Ct值

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Conclusion

本研究开发的RNA提取方法（将TRIzol试剂与硅胶膜离心柱纯化相结合）显著降低了试剂成本和处理时间，同时保持了RNA产量和纯度。这种优化的方法为DSS诱导的结肠炎模型和其他动物疾病研究中的高效、高质量RNA提取提供了一个强大且具有成本效益的方法框架。

Optimized TRIzol–silica column RNA extraction for DSS-colitis: resolving PCR inhibition

Jie Lin, Jiacheng Zhang, Adria Morales Santiago, Quancai Sun*

Department of Health, Nutrition and Food Sciences, Florida State University, Tallahassee, FL, 32304, USA

*Corresponding author.

Abstract

Dextran sulfate sodium (DSS) is widely used to induce experimental colitis in animal models, facilitating the investigation of inflammatory bowel disease (IBD). However, its strong polyanionic nature interferes with RNA extraction and suppresses reverse transcription and polymerase chain reaction (PCR) amplification, compromising downstream quantitative PCR (qPCR) analyses. Conventional RNA purification methods, such as lithium chloride precipitation and commercial kits, are limited by time, cost, and efficiency. This review outlines the key challenges associated with RNA isolation from DSS-treated tissues and presents an optimized extraction protocol integrating TRIzol with silica spin column purification. The method is systematically evaluated in mouse colonic tissues from DSS-induced colitis models, focusing on its compatibility with downstream qPCR analysis of pro-inflammatory cytokine expression.

Reference:

Lin, J., Zhang, J., Santiago, A.M. et al. Optimized TRIzol–silica column RNA extraction for DSS-colitis: resolving PCR inhibition. Agric. Prod. Process. Sto. 1, 24 (2025). https://doi.org/10.1007/s44462-025-00030-8

翻译：田雨欣（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意

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