Advanced Genetics｜纳米孔直接RNA测序用于RNA修饰检测：信号到位点的解析流程

为什么要关心 RNA 修饰？

RNA 不仅仅是基因信息传递的中间产物，其本身还携带多种化学修饰，这些修饰为基因表达调控提供了一层动态而精细的调控机制。目前已发现超过 170 种 RNA化学修饰，广泛分布于mRNA和各类非编码RNA中，包括m6A、m5C、Ψ、ac4C、Nm、m1A、m7G、A-to-I 等。它们通过影响 RNA 的稳定性、剪接、翻译和定位等过程，参与发育调控、维持生理稳态，并与多种疾病密切相关。传统的 RNA 修饰检测方法（如 LC-MS/MS、ELISA、SELECT、MeRIP-seq、miCLIP、RNA-BisSeq 等）虽在揭示 RNA 修饰方面取得了重要成果，但也存在显著局限：依赖抗体或化学标记的方法易产生特异性不足或交叉反应；实验流程复杂，可能引入系统性偏好；逆转录等步骤会破坏 RNA 的原生修饰信息；对低丰度转录本或同一分子上多重修饰的识别能力有限。当前，尽管短读长 RNA 测序技术推动了全转录组范围的 RNA 修饰研究，但由于读长和逆转录步骤的限制，准确性仍需提高，且难以实现多种修饰的同时识别。这些挑战使得开发更高精度、无偏、可同时检测多修饰的新方法成为 RNA 修饰研究的重要方向。

图1、真核 mRNA 中的多样化化学修饰

Nanopore 直接 RNA测序：检测RNA修饰的新利器

Oxford Nanopore Technologies（ONT）开发的直接 RNA 测序（Direct RNA Sequencing, DRS）技术是一种具有革命性意义的长读长测序方法。它摒弃了传统 RNA 测序中的 PCR 和逆转录步骤，能够直接读取天然 RNA 分子的序列，从而完整保留其化学修饰信号。在该平台中，RNA 分子在电压驱动下穿过纳米孔道，不同碱基及其化学修饰会引起特征性的电流扰动，通过结合机器学习等算法对电流信号进行分析，即可在单分子、单碱基水平上识别 RNA 修饰。该技术具有显著优势：一是能够在原生状态下读取 RNA，避免修饰信息丢失；二是具备单分子、单碱基分辨率，理论上可检测每个 RNA 分子的修饰；三是能同时识别多种修饰类型，不仅限于m6A，还可检测 m5C、Ψ、ac4C、Nm、m1A、m7G、A-to-I等修饰。当前，基于ONT的m6A修饰检测方法已相对成熟，而针对其他修饰（如 Nm、ac4C、m7G、Ψ 等）的识别算法仍在快速发展之中。在本综述中，我们不仅总结了利用 DRS 数据识别m6A修饰的最新进展与应用，更将重点关注那些相对被忽视的修饰类型（如Ψ、ac4C、Nm、m1A、m7G、A-to-I编辑），综述其在 Nanopore DRS 平台下的研究现状、算法发展与未来面临的挑战。

图二、ONT DRS 测序工作流程及 RNA 修饰检测示意图

Nanopore 直接 RNA测序：检测RNA修饰的新利器

m6A是目前研究最为深入、分布最广泛的 RNA 化学修饰，在转录后调控、RNA 命运决定及疾病发生中发挥重要作用。基于DRS数据的m6A检测，也成为 RNA 修饰研究方法发展的“风向标”。

早期研究多基于信号统计或错误率差异的策略，如 Tombo、DiffErr、DRUMMER 等工具通过分析电流信号偏离或 basecalling 错误率（如 mismatch、插入、缺失）的变化，对比对照与敲除样本以定位潜在修饰位点，思路直观且实现简便。随后，经典机器学习方法被引入该领域，如 EpiNano、MINES、Nanom6A、Yanocomp 等工具综合信号特征、错误率与序列特征（如 DRACH motif），利用监督学习模型（如随机森林、XGBoost）进行修饰预测，并常借助 CLIP-seq 或 MeRIP-seq 数据提升精度。

这类方法成熟高效，但对训练集依赖较强，对低丰度或非经典序列位点的识别能力仍有限。近年来，深度学习策略的兴起推动了m6A检测的进一步发展，研究者利用 Bi-LSTM、WaveNet、残差网络及卷积–递归混合架构等深层神经网络从原始电流信号中自动提取特征，实现高精度预测。

其中，m6Anet 采用多实例学习（MIL）框架，在无显式标签条件下通过单分子特征识别修饰位点与丰度；DENA、m6ATM、RedNano、Xron 等模型通过复杂网络结构和特征融合提升模型的跨物种与跨实验条件泛化能力；而 Pum6a、m6Aiso、SingleMod 等方法则致力于单分子层面的m6A定量与异构体检测。此外，m6ABasecaller、DEMINERS 等 pipeline 尝试将修饰检测直接嵌入 basecalling 流程，实现高通量与实时分析。

随着 DRS 技术的成熟，其应用已从m6A扩展至 Ψ、Nm、m1A、5moU 以及A-to-I编辑等多种修饰，但由于这些修饰对电流信号扰动更为细微且训练数据稀缺，其识别仍具挑战。代表性工作包括 ModQuant 模型利用合成修饰 RNA 序列进行 Ψ 的监督学习预测，NanoPsu、Penguin、IndoC、Mod-p ID、NanoPsiPy 等方法基于信号差异实现无需对照样本的 Ψ 检测；m1A-prediction 模型通过分析电流信号特征并结合 XGBoost 实现单分子层面的m1A检测；Dinopore 结合电流信号、basecalling 误差及质量分数训练 CNN 模型，实现对A-to-I编辑的高准确度识别，并具有良好的跨物种泛化能力；而 Nm-Nano 与 NanoML-5moU 则利用机器学习分类器结合信号特征与 k-mer 嵌入实现 Nm 与 5moU 修饰的高精度定量分析。

值得注意的是，在真实 RNA 分子中，多种修饰往往共存或相互作用（cross-talk），因而研究者逐渐从单一修饰检测转向多修饰协同分析。为应对这一复杂性，新的计算框架相继被提出，如利用迁移学习与多标签深度学习模型同时预测多种修饰（如 TandemMod 模型），或通过对比修饰样本与对照样本信号分布差异识别潜在修饰（如 Nanocompore、xPore）。

此外，无监督与异常检测模型（如 nanoDoc）通过学习未修饰信号分布来发现未知修饰，而 ONT Dorado + Remora 框架则将修饰识别直接嵌入 basecalling 流程，实现多修饰的实时联合检测。部分模型（如 modCnet）更针对特定修饰组合（如ac4C与m5C）进行联合建模，以捕捉修饰间的共存模式。这些进展表明，基于 Nanopore DRS 的 RNA

总结与展望：

尽管 Nanopore 直接 RNA 测序（DRS）技术在 RNA 修饰检测领域取得了显著进展，但仍面临多方面挑战。低丰度修饰的信号常被噪声淹没，导致检测灵敏度不足；训练数据匮乏使模型泛化能力有限，难以适应不同物种或条件；相邻或共存修饰的信号重叠以及 RNA 结构、测序速度等因素造成的复杂扰动，使修饰识别更加困难。此外，缺乏统一、可靠的验证数据集和评估标准，导致不同工具结果难以直接比较。尽管如此，DRS 的潜力正在逐步显现，其应用正从方法验证走向真实的生物学与医学场景。研究者已利用 DRS 在单次测序中识别多种修饰（如 m6A、Ψ、m5C 等），并揭示植物胁迫响应、白血病甲基化差异及微生物m6A图谱等现象，为理解修饰调控提供了新的视角。展望未来，DRS 驱动的 RNA 修饰研究将继续向单分子精度和多修饰联合建模方向发展，通过信号解卷积、结构感知和深度学习进一步提升识别能力。修饰检测将逐步与 basecalling 过程融合，实现实时、准确的分析，并与蛋白质组学、空间转录组和单细胞组学结合，构建多维的修饰–功能网络。同时，标准化的评测体系与开放数据集将提升方法可比性与可靠性。随着技术与算法的持续进步，Nanopore DRS 有望在疾病诊断、RNA 药物与疫苗设计等领域实现应用落地，推动我们从“观察修饰”迈向“理解并利用修饰”的新阶段。

第一作者简介

刘雅然

刘雅然，理学博士，滨州医学院讲师，主要从事RNA生物标志物的鉴定及疾病进展相关分子机制的研究。她近期的研究重点在于揭示肿瘤发生发展的关键调控通路，探索潜在的诊断与治疗靶点，并开发先进的生物信息学工具，用于分析和解读复杂的分子数据。她的研究工作结合了计算方法与实验生物学，系统性地探究驱动肿瘤生长的分子相互作用。相关研究成果已发表在Genomics和Genomics, Proteomics & Bioinformatics等国际知名期刊上。

通讯作者简介

孙强

孙强，理学博士，浙江大学医学院附属第四医院/浙江大学“一带一路”国际医学院/浙江大学国际健康医学研究院特聘副研究员。主要研究方向为肿瘤泛基因组及肿瘤中复杂剪接事件研究。以第一或通讯作者（含共同）在Cell Systems，Genome Medicine，Analytical Chemistry，Clinical and Translational Medicine及Journal of Molecular Cell Biology等知名国际期刊发表20余篇学术论文，总引1000余次。主持多项国家级、省部级课题，任iMeta，Interdisciplinary Medicine，Cell Proliferation等期刊编委。

李阳

李阳，理学博士，四川省医学科学院·四川省人民医院副研究员，主要研究方向为开发用于基因编辑的新型分子工具及探究RNA修饰的生物学功能。以第一或通讯作者（含共同）在Angewandte Chemie International Edition，Cell Systems，Clinical and Translational Medicine及Journal of Molecular Cell Biology等知名国际期刊发表10余篇学术论文。

论文信息

Advances in Detecting RNA Modifications Using Direct RNA Nanopore Sequencing

Yaran Liu, Yang Li, Qiang Sun

Advanced Genetics

DOI:10.1002/ggn2.202500041

https://doi.org/10.1002/ggn2.202500041

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