上海大学苏佳灿教授AM：智能水凝胶实现时序调控骨再生

骨缺损由先天性疾病、肿瘤切除或创伤引起，是临床面临的重大挑战，因为骨骼组织自身的再生能力有限。虽然同种异体和自体骨移植是治疗临界尺寸缺损的临床金标准，但其应用受到免疫并发症、供区发病率和整合效率欠佳的限制。基于水凝胶的生物材料因其含水基质结构、可调节的生物力学特性以及模拟天然细胞外基质微环境的能力，已成为有前景的替代方案。然而，依赖被动分子封装或简单扩散机制的传统水凝胶系统，从根本上无法满足成功骨再生所需的时空协调，特别是血管生成、成骨和矿化之间精确编排的相互作用。当前策略主要侧重于单一的生物学过程，缺乏动态响应能力来重现自然的骨愈合级联反应。

近日，上海大学苏佳灿教授、张琴副研究员、周东阳博士和苏州大学‌郑厚峰教授开发了一种酶响应性脱氧核糖核酸-聚乙二醇水凝胶，通过合理的材料设计，能够主动协调血管生成、成骨和矿化的顺序过程。该水凝胶整合了基质金属蛋白酶可切割肽交联的PEG网络，并与肌动蛋白稳定的血管内皮生长因子结合DNA链偶联，实现了时空控制的治疗释放。植入后，MMPs触发水凝胶降解，释放VEGF诱导血管生成，同时促进成骨分化。肌动蛋白稳定的DNA框架在此阶段保持结构完整性，防止磷酸盐过早释放。随后的基质重塑释放核酸酶，催化DNA产生磷酸根离子，这些离子与水凝胶中的肽和内源性钙协同作用驱动矿化。相关论文以“Enzyme-Programmable DNA-PEG Hydrogel Spatiotemporally Regulates Bone Regeneration Microenvironment”为题，发表在

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图1：用于时空控制骨再生的酶响应DNA-PEG水凝胶平台的工程原理和机制。 A) 水凝胶设计策略，涉及将MMP可切割肽交联的PEG网络与VEGF结合DNA链共价连接，创建多酶响应智能水凝胶。 B) 动态调控机制：i) MMP介导的水凝胶降解实现细胞浸润；ii) 持续VEGF释放诱导血管生成和成骨分化；iii) 核酸酶介导的降解DNA链释放磷酸根离子，与肽片段和内源性钙离子相互作用驱动矿化；共同通过同步的血管生成-成骨-矿化级联建立自我调节的微环境，加速骨再生。

研究人员首先成功构建了这种酶响应DNA-PEG水凝胶系统。核磁共振氢谱和傅里叶变换红外光谱证实了8臂PEG-诺硼烯大分子的成功合成。流变学测量显示，在紫外光照射下，储能模量在10秒内迅速超过损耗模量，表明PAV水凝胶能快速凝胶化。可视化观察和实验证明了其优异的可注射性和可塑性，适用于不规则形状的组织缺损。共聚焦显微镜显示DNA在PAV水凝胶中均匀分布，而Cryo-SEM图像显示所有水凝胶均具有明确且相互连接的多孔结构，孔径约为15微米，且DNA和VEGF的掺入未显著改变水凝胶的微观结构或机械性能。EDS分析检测到PAV水凝胶中存在磷元素，进一步验证了DNA的成功修饰。接触角测量显示所有水凝胶具有适中的亲水性，有利于细胞附着和营养交换。溶胀行为评估表明水凝胶在PBS中21天内保持稳定。在不同浓度的胶原酶I中，水凝胶表现出剂量依赖性降解，这归因于MMP可切割肽交联剂的掺入。

图2：水凝胶的表征。 A) 8臂PEG-COOH和8臂PEG-NB的1H-NMR谱图。 B) PAV水凝胶在紫外照射下的流变学测量。 C) 紫外照射下凝胶化转变的照片。 D) 水凝胶的可注射性和可塑形性演示。 E) 共聚焦显微镜图像显示水凝胶内DNA分布。 F) 水凝胶微观结构的Cryo-SEM图像。 G) 水凝胶内孔径定量分析。 H) EDS图谱显示PAV水凝胶中元素分布。 I) 水凝胶杨氏模量的3D映射。 J) 杨氏模量分析。显著性差异标示为ns。

分子对接模拟揭示了VEGF与DNA链之间清晰的形状互补和位点特异性识别，存在氢键相互作用，MM/GBSA结合自由能计算表明其结合是自发且稳定的。体外VEGF释放实验显示，PAV水凝胶表现出持续释放特性，21天内释放约75%的VEGF，而物理负载VEGF的PV水凝胶释放更快。琼脂糖凝胶电泳和紫外-可见光谱证实了DNA链的高纯度、结构完整性及其成功加载到水凝胶中。此外，DNA链还可作为生物可利用的磷酸盐来源。在核酸酶T处理后，不含肌动蛋白的PA水凝胶磷酸盐释放量显著更高，而含肌动蛋白的组别磷酸盐释放可忽略不计，证明了肌动蛋白对DNA结构的稳定作用。

图3：水凝胶的酶响应降解和释放行为。 A) P、PA、PV和PAV水凝胶的代表性接触角图像。 B) 水凝胶在PBS中21天内的溶胀行为。 C) 水凝胶在PBS和不同浓度胶原酶I溶液中的体外酶降解。 D) 基于AlphaFold分子对接预测的VEGF与水凝胶基质中DNA链结合的示意图。 E) DNA链与VEGF相互作用能的计算。 F) PV和PAV水凝胶在21天内的累积VEGF释放曲线。 G) DNA链的琼脂糖凝胶电泳。 H) P和PA水凝胶的紫外-可见吸收光谱。 I) 核酸酶T处理1天后磷酸根离子释放的定量。显著性差异分别标示为ns和*** p < 0.001。

分子动力学模拟阐明了水凝胶介导矿化的分子机制。时间分辨快照显示，在100纳秒模拟过程中，DNA降解产生的PO₄³⁻、内源性Ca²⁺和肽在水凝胶基质中逐渐聚集。径向分布函数分析表明PO₄³⁻与肽的相互作用更强，表明PO₄³⁻最初在肽结构域周围积累，形成预组织基质，随后与Ca²⁺相互作用。RMSD、Rg和SASA分析表明系统结构稳定并趋于紧凑。这些发现表明矿化是一个两步过程。透射电子显微镜和EDS分析在体外矿化实验中证实了磷酸钙的形成，支持了模拟提出的机制。

图4：水凝胶介导矿化的分子动力学模拟。 A) 100 ns模拟过程中PO₄³⁻、Ca²⁺和肽的时间分辨分子动力学快照和密度热图。 B) 分子对接预测的相互作用示意图。 C) 分子几何结构。 D) 20 ns时PO₄³⁻-肽和100 ns时PO₄³⁻-Ca²⁺的径向分布函数。 E) 系统的RMSD曲线。 F) 系统的回转半径曲线。 G) 系统的溶剂可及表面积曲线。 H) 水凝胶介导矿化形成的磷酸钙的TEM图像。 I) 肽和DNA链在模拟体液中孵育后产物的EDS图谱。

体外生物相容性评估显示，所有水凝胶对BMSCs和HUVECs均表现出优异的生物相容性和支持细胞增殖的能力，其中PAV水凝胶由于DNA链介导的VEGF持续释放，对HUVEC增殖的促进作用最强。细胞骨架染色显示细胞在水凝胶表面铺展良好。实时PCR分析显示，与PAV水凝胶共培养的HUVECs中血管生成相关基因表达显著上调。体外成管实验表明，PAV水凝胶能显著增强毛细血管样网络的形成。通过transwell共培养系统评估成骨诱导潜力，结果显示PAV水凝胶在早期ALP活性和晚期钙沉积方面均表现出最强的成骨信号，并显著上调了BMSCs中成骨相关基因的表达。

图5：水凝胶的体外生物相容性和血管生成特性。 A) BMSCs和B) HUVECs与水凝胶共培养的活（绿）/死（红）染色 assay。 C) BMSC和D) HUVEC增殖的CCK-8 assay。 E) 在水凝胶表面生长的BMSCs和HUVECs的F-肌动蛋白染色。 F) 与水凝胶共培养的HUVECs中血管生成相关基因的表达水平。 G) 与水凝胶共培养的HUVECs成管实验的示意图和代表性图像。 H) 成管定量分析。显著性差异标示为ns, *p < 0.05, **p < 0.01 和 ***p < 0.001。

图6：水凝胶的体外成骨效应。 A) 评估BMSCs成骨分化的transwell共培养系统示意图。 B) ALP染色和D) ARS染色的代表性图像。 C) ALP染色和E) ARS染色的定量。 F) BMSCs中成骨基因的表达。显著性差异标示为ns, *p < 0.05, **p < 0.01 和 ***p < 0.001。

在大鼠颅骨缺损模型中进行的体内实验进一步验证了水凝胶的骨再生能力。Micro-CT分析显示，植入PAV水凝胶12周后，缺损区域出现广泛的骨桥接和致密矿化骨，其骨体积分数、骨小梁数量和骨矿物质密度均显著高于对照组。激光散斑对比成像显示PAV组在早期血管化方面增强。体内水凝胶降解监测显示所有组别具有相当的降解速率。组织学和免疫组化分析表明，PAV组在12周时形成了最广泛且组织良好的板层骨，胶原沉积更密集，BMP-2、OCN、CD31和α-SMA的表达也最高。转录组测序分析发现，PAV组新生骨组织中多个促血管生成基因和成骨基因上调，GO和KEGG富集分析揭示了在骨矿化、骨重塑、血管发育以及VEGF、MAPK等信号通路上的显著富集。

图7：在大鼠颅骨缺损模型中水凝胶的体内骨再生评估。 A) 体内实验时间线示意图。 B) 水凝胶植入后骨再生示意图。 C) 第6周和第12周的Micro-CT图像。 D, E, F) BV/TV、Tb.N和BMD的定量分析。 G) 术后12周缺损部位血流的激光散斑对比成像。 H) 体内水凝胶降解。 I) 体内水凝胶降解定量。显著性差异标示为ns, *p < 0.05, **p < 0.01 和 ***p < 0.001。

图8：骨再生的组织学和免疫染色评估。 A) 骨组织H&E和B) Masson染色的代表性图像。 C) BMP-2和D) OCN免疫组织化学染色的代表性图像。 E) CD31和F) α-SMA免疫荧光染色的代表性图像。

图9：新生骨组织的RNA-seq分析。 A) PAV水凝胶组与对照组之间差异表达基因的火山图。 B) 血管生成和成骨相关基因表达水平的热图。 C) PAV水凝胶组与对照组之间的GO富集分析和D) KEGG通路富集分析。

这项研究成功开发了一种新型酶响应DNA-PEG水凝胶系统，能有效协调血管生成-成骨-矿化级联反应，显著增强骨再生。该智能生物材料能够动态调控骨再生微环境，为复杂组织修复提供了新的可能性。尽管该水凝胶在骨修复方面表现出色，但其从实验室到临床的转化仍处于早期阶段。未来需要进一步研究，包括GMP级生产和在大型动物临界尺寸缺损中的疗效验证，以完善该平台并推动其走向临床应用。