元码环化策略| 根据序列内源性的单茎环结构，设计环状RNA前体

今天，我们继续分享元码Uni-cRNA-PIE 环化平台—依据待环化序列内部的单茎环结构（SL 元件），设计环状 RNA 前体。

在 IRES 序列中，寻找 SL 元件，设计 Uni-cRNA-PIE 线性前体

待环化序列为 CVB3 IRES+Gluc，采用 Uni-cRNA-PIE 环化策略，设计环化 RNA 线性前体序列的具体操作与 Hi-Scarless-PIE 线性前体的设计类似。首先，根据 CVB3 IRES 的二级结构，找到位于 CVB3 IRES 的第 183 至第 232 位的 SL 元件（单茎环），命名为 Stem‑loop‑CVB3‑IRES。接下来，将剪接位点设计在 SL 元件的端环处，即位于 Stem‑loop‑CVB3 IRES 序列的第 24 位 U 和第 25 位 C 之间。然后，将成环的待环化序列从选定的剪接位点处断裂，形成目标环状 RNA 序列对应的线性对应体。最后，将 Ana‑PIE 核酶的 3'端切片、目标环状 RNA 序列的线性对应体和突变改造后的 Ana‑PIE 核酶的 5'端切片依次连接，形成 Uni-cRNA-PIE-IRES-端环线性前体。此外，研究人员还将剪接位点设计在 SL 元件的内环处，即位于 Stem‑loop‑CVB3 IRES 序列的第 16 位 U 和第 17 位 C 之间，形成 Uni-cRNA-PIE-IRES-内环线性前体。

在 CDS 序列中，寻找 SL 元件，设计 Uni-cRNA-PIE 线性前体

依据 Gluc CDS 序列中的 SL 元件，研究人员设计了两种 Uni-cRNA-PIE 线性前体：一种是将剪接位点置于天然 CDS 序列的 SL 元件端环处；另外一种是将剪接位点置于LinearDesign 优化后的 CDS 序列的 SL 元件端环处。

环化效率对比

研究人员比较不同设计的 Uni-cRNA-PIE 线性前体的环化效率，结果显示：第一，对于基于 IRES-SL 元件设计的环化前体来说，将剪接位点置于 SL 元件的端环处可高效环化，而将剪接位点置于 SL 元件的内环处使得环化效率变得极低；第二，基于天然CDS-SL 元件设计的环化前体与密码子优化后的CDS-SL 元件设计的环化前体相比，两者的环化效率相当。

小结

研究人员发现，人类 5 '‐UTR、人类 CDS、人类 3 '‐UTR、IRES、非编码RNA 序列集里,含有至少一个 stem loop 的序列的占比分别为 99 .69%、99 .99%、99 .85%、98 .72%和 100%。对于编码目标蛋白的环状 mRNA 来说，使用 IRES+CDS 序列组合时，几乎能在 100%的组合序列里找到 SL 结构元件，从而构建“核酶-SL 环化模块”，高效环化制备环状 mRNA。同时，SL 元件几乎存在于所有非编码 RNA 中，因此也可以通过构建“核酶-SL 环化模块”实现非编码 RNA 的高效环化。总的来说，Uni-cRNA-PIE 环化系统几乎能够对任意 RNA 分子实现高效环化，是一种通用、高效率、无痕的 RNA 环化新策略。

参考文献

1. 一种通用的制备环状RNA的方法及其用途，申请公布号119662636 A.

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