Mol Ther丨解析听觉OTOF基因治疗重组疗效：动物模型揭示蛋白重组优于核酸重组

编码Otoferlin的OTOF基因病理性突变可导致常染色体隐性耳聋9 （DFNB9）【1-2】 。功能性Otoferlin的缺乏使DFNB9患者表现为先天性重度至完全感音神经性听力损失【3-5】 。 基于核酸重组或蛋白重组的双AAV治疗体系成功挽救大基因OTOF模型耳聋小鼠听力 。但是， 核酸重组和蛋白重组在OTOF双AAV治疗体系疗效上的本质差异仍然缺乏深入探究，影响包括但不限于OTOF乃至更广泛致聋基因在内的潜在治疗体系开发，以实现的最佳疗效挖掘使耳聋患者康复的最大获益。

近日，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来教授等团队在Molecular Therapy杂志发表了题为Comparative analysis of RNA versus protein splicing in dual AAV-mediated gene therapy in a mouse model of DFNB9 deafness的研究文章，利用动物模型从听力学、组化学、电生理等在长时间尺度上系统评价了核酸重组和蛋白重组在疗效上差异。

世界卫生组织数据显示，全球20%的人有不同程度的听力损失，5%的人患有致残性（中度以上）的听力损失，约有2600万先天性耳聋患者。每年，我国约有3万新生聋儿。听力障碍，不仅仅意味着失聪，更常伴随着言语障碍，“十聋九哑”成为了残酷的现实。而约60%的先天性耳聋是由遗传因素所导致的，已知的耳聋基因超过200多个，目前尚无任何临床获批治疗药物。目前研发的突破针对的是耳畸蛋白缺陷（OTOF耳聋基因突变）所致的耳聋。

研究团队构建了5种双AAV治疗系统，包括AAV1-Myo15-AK、AAV1-Myo15-AP、AAV1-Myo15-TS、AAV1-CMV-AK和AAV1-CMV-intein。基于核酸重组策略中，AAV1- Myo15-AK将Otof -/-小鼠的听力恢复到55-70 dB，优于AAV1- Myo15-AP和AAV1- Myo15-TS。基于蛋白重组策略，AAV1-CMV-intein使Otof -/-小鼠听力恢复到35-70 dB，优于AAV1-CMV-AK，在新生和成年小鼠的中均持续了12个月以上。在新生鼠Otof -/-治疗后 1 个月时，我们观察到在AAV1-CMV-intein组中，顶圈、中圈和底圈的 IHC 中表达 Otoferlin 的百分比分别为 68.30% ± 3.78%、67.05% ± 8.46% 和 68.59% ± 6.36%，而在 AK 组中，这三个圈的 IHC 中 Otoferlin 的表达分别为 58.03% ± 8.12%、58.35% ± 5.24% 和 58.74% ± 10.67%。intein组的 Otoferlin 表达与 AK 组相似。而在新生鼠治疗5 个月后，intein 组的耳蜗顶圈、中圈和底圈中Otoferlin 表达分别为 66.18% ± 5.50%、81.83% ± 4.83% 和 71.75% ± 6.93%；而 AK 处理的耳蜗中分别为 28.82% ± 6.86%、23.14% ± 5.72% 和 19.12% ± 7.42。这些结果表明，在顶圈、中圈和底圈中，intein组中全长 Otoferlin 的稳定表达高于 AK 。治疗组中突触数量恢复也得到了相似的结果，在注射后 1 个月和 5 个月时，对Otoferlin蛋白表达内毛细胞中 Ctbp2 标记的带状突触数量进行了计数。在治疗后1个月时，intein组（10.30 ± 0.30）的带状突触数量高于 AK 组（8.77 ± 0.3）。5 个月后，intein 组的突触数量（9.71 ± 0.36）仍高于 AK 组（7.40 ± 0.30），这一结果与听力恢复水平和 Otoferlin 表达水平一致。而我们在成年小鼠治疗中也得到了类似的结果。

多年来，复旦大学舒易来教授等团队创新采用双腺相关病毒（AAV）载体递送系统，以基因置换策略，将正常的人源OTOF编码序列导入患者内耳感受声音的毛细胞，促使毛细胞能够表达正常功能的耳畸蛋白，从而从根本上改善听力和言语。

该研发面临两大挑战。首先是递送系统的构建。AAV是最常用的基因治疗递送载体，但OTOF基因编码序列超出了单个载体的装载容量。研究团队采用双AAV载体拆分递送策略，成功突破单载体基因容量限制的技术瓶颈，在耳蜗细胞内实现基因序列的精准重组。二是给药困难。耳蜗位置深、细胞种类多，且被骨质结构包绕，针对耳蜗靶向递送的技术挑战，团队经过反复摸索，自主研发出了一套精准、微创的耳部递送路径和给药装置，为耳聋基因治疗提供了重要保障。

本研究表明，蛋白重组比核酸重组对OTOF模型鼠的基因治疗更有效。这为未来选择双载体基因治疗OTOF突变及其他大基因突变的重组策略提供了客观基础依据。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1525001625008238

制版人：十一

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