GLP一般毒理研究试验方案的组成

本文介绍下GLP一般毒理研究（如单次和多次给药毒性试验）试验方案的组成。主要参考《A Comprehensive Guide to Toxicology in Nonclinical Drug Development》一书中的第6章节。

1. 遵守良好实验室规范（GLP）声明

所有用于评估药物安全性的一般毒理研究（单次和多次给药毒性试验）都应在GLP条件下进行。当然，不仅一般毒理研究，生殖毒性（Ⅰ段、Ⅱ段、Ⅲ段）、致癌性、遗传毒性（如Ames、染色体畸变和小鼠淋巴瘤试验）、局部毒性试验、免疫原性试验、安全药理学试验、依赖性试验、毒代动力学试验等均需要在GLP认证通过的机构开展。所以，在试验方案中需要包含GLP依从性声明。这点看似普通，直至现在，依然有企业在这块吃亏。有的企业，最初申报IND时，仅计划在国内开展临床研究，故方案中参照的GLP法规仅体现了NMPA《药物非临床研究质量管理规范》，后期开发过程中，想用该数据申报美国或其它法规国家，因方案中未声明遵守目标国家的GLP法规情况，遭到拒绝。

2. 计算机化系统

用于数据生成、测量或评估的计算机化系统，应按照符合GLP原则的方式进行开发、验证、操作和维护。

3. 委托方信息、研究机构信息、专题名称、研究目标

方案中应体现委托方、GLP机构、专题名称、专题代号等信息。

研究目标：根据产品具体适应症和类型，一般毒理研究的目标有很多，比如确定“未观察到不良效应水平（NOAEL）”；描述重复给药后的剂量-效应关系；确定并描述重复给药后受影响的特定靶器官、恢复情况；为更长周期重复给药毒理研究提供剂量设计依据。

4. 受试物

毒性研究中使用的受试物应是申请人计划在人体临床试验中使用的同一物质。如果可能，整个研究应使用同一批次的受试物。如果单一批次无法完成研究，则应使用纯度和组成相似的批次。

关于这点，大部分企业会选择制备两批次样品，一批non-GMP毒理批样品，一批GMP临床批样品，顾名思义，前者主要用于支持非临床毒理研究的开展，后者则用于临床试验。当然，两批次样品质量肯定要具备可比性的。

5. 鉴别、组成和纯度

应明确受试物的鉴别、组成和纯度，包括所有主要成分的名称和含量、已知杂质和污染物以及不可识别成分的百分比。

6. 储存条件和有效期

受试样品应储存在能够维持其稳定的条件下，直至研究完成。受试物的有效期应明确，不得使用超过有效期的受试物。

7. 试验系统和饲养管理

对于大多数药品，通常需要两种种属进行毒理研究：啮齿类动物和非啮齿类动物。

大多数国家都有关于动物的护理、维护和饲养的建议和法律要求，这些要求在所有GLP中都被明确规定。

以下是一些关于研究中动物使用方面的国际政府法规/指南的简要列表：

美国国立卫生研究院（NIH）出版物85e23，《实验动物护理和使用指南》

《实验动物护理和使用指南》第八版（NRC 2011）

欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约：ETS 123附录A；关于用于科学目的的动物保护的指令2010/63/EU

日本科学委员会2006年6月1日发布的《动物实验正确操作指南》

动物福利法7 Usc 2131等（PL 89e544，1966年8月24日；修正案PL 91e579，1970年12月24日；修正案PL 94e279，1976年4月22日；修正案PL 99e198，1985年12月23日）

8. 物种、品系、性别和数量的选择

试验方案中应给出物种、品系、性别和动物数量选择的理由。

如果研究中仅使用一种性别，则应根据预期的临床用途或既往数据进行合理说明。在大多数毒理研究中，应同时使用雄性和雌性动物。

所有试验动物必须健康，且未接受过任何的事先实验操作。

9. 动物年龄和标识

在啮齿类动物中，毒理试验通常从6到8周龄开始。在非啮齿类动物中，毒理试验通常在动物接近性成熟时开始（非人灵长类动物除外）。NMPA《重复给药毒性研究技术指导原则》明确规定，应根据试验期限和临床拟用人群确定动物年龄，一般大鼠为6～9周龄，Beagle犬6～12月龄，猴3～5岁，动物年龄应尽量接近，应注明开始给药时动物年龄。关于猴年龄问题，FDA申报资料中低于3岁的动物用于一般毒理研究并不罕见，但国内监管机构对这一细节更加关注，前几年也因为使用低年龄段动物，出现过风波，所以现在各机构已经很注意动物年龄的合规性。

试验动物应进行个体标识，其饲养环境也应标明其物种、品系（和亚品系）、性别、年龄和唯一标识号码（例如耳标、植入式标识芯片和动物纹身标识）。

10. 动物随机化

动物应以分层随机的方式分配到对照组和供试品组，以尽量减少偏差，并确保供试品处理组和对照组之间相关变量的可比性（如平均体重和体重范围）。

如果使用其他特征作为随机化的依据，则应进行描述和合理说明。

尽可能在同一天将动物纳入研究。如果动物数量过多而无法在一天内完成分配，则可以在几天内分批将动物纳入研究，但每天应将相等比例的对照动物和实验动物纳入研究，以保持同时性。

11. 基础饮食

在毒理研究中，应为动物提供自由采食和饮水，且这些研究的饲料应满足物种正常生长和繁殖的营养需求。

除非有特殊情况需要其他安排，否则应确保受试物处理组动物的饲料与对照组动物的饲料具有相同的热量密度，并且含有相同水平的营养成分（例如纤维、微量营养素）。

12. 对照组和供试品组

需要设置一个与受试动物同时进行的对照组。

应给予对照动物与受试物相同的载体或溶剂，其体积应与任何给药组动物所接受的最大载体或溶剂体积相等。

应有足够的毒理学信息来确保所使用的载体或溶剂不会影响研究结果。如果关于用于施用受试物的载体或溶剂的毒性信息不足，则应增加一个未暴露于载体或溶剂的额外对照组。

其他方面，对照组动物应与给药组动物接受相同的处理。

至少应设置三个剂量水平（加上同时进行的对照组），给药途径应与人体预期暴露途径相同，最低剂量应无明显毒性，最高剂量应产生明显的毒性，表现为以下情况：

死亡或发病（不推荐作为终点，但可以使用）；饲料消耗量变化；体重变化；毒性体征；临床病理学；组织病理学

13. 恢复期组

在至少一项毒理学研究中，通常需要进行恢复期评估，即在给药阶段结束后增加一个非暴露期，专门用于确定任何与受试物相关的毒理发现的潜在可逆性。

14. 给药途径和持续时间

受试物的给药途径应尽可能接近人体正常暴露途径。如果使用其他途径，则应提供理由。在整个研究中，所有试验动物应使用相同的给药方法。

除非有药理学证据表明每日给药并无必要，或者这不是人体预期给药方案（如某些生物药物半衰期长，给药间隔久），否则动物应每日暴露于受试物。

给药周期视临床拟用方案而定，具体可参见ICH M3。

15. 体重和饲料摄入数据

试验动物每周至少称重一次。

在亚慢性毒性研究期间，每周应测量饲料消耗量（如果受试物通过饮用水给药，则测量饮水量）。

16. 临床观察

应进行眼科检查、血液学分析、临床生化检测和尿液分析。不晓得为什么该书会将这些指标纳入Clinical Observations，尊重原作，保留原文内容（下文会逐一介绍）。不过，除了以上指标，体温、血压、心电图等也是常规毒理检测终点指标，正常情况下，在方案中也要体现。

17. 毒代动力学

应进行系统暴露评估，以确认给药剂量与血药浓度的关系，评估剂量比例关系，比较急性暴露与重复暴露之间的潜在差异，评估蓄积/饱和动态，并确定是否存在性别差异。

18. 免疫原性

抗药物抗体的评估适用于生物药物、多肽或寡核苷酸等药物形式，这些分子足够大，可能引发免疫反应。

这些评估在一般毒理研究中的主要目的是确定抗药抗体是否可能改变其暴露特征，从而改变一般毒性判定中的系统暴露标准。

在进行重复给药毒性研究时，应测量与这些产品相关的抗体，以帮助解释毒理研究结果。抗体反应应进行特征分析，并与药理学和/或毒理学变化相关联。

在解释研究结果时，应考虑抗体形成对药代动力学/药效学参数、不良反应的严重程度、补体激活或新毒性效应出现的影响。

19. 免疫毒性

免疫毒性参数的评估采用分层方法进行。初步评估包括标准临床病理学和病理学。如果这些评估的数据表明对免疫系统可能存在影响，则需要进一步评估。

当在标准非临床毒性研究中观察到免疫抑制的证据，例如骨髓抑制、全血细胞减少、白细胞减少、淋巴细胞减少或其他血液异常，或免疫系统器官重量和组织学改变（例如，胸腺、脾脏、淋巴结或骨髓等免疫系统组织的低细胞性），或肿瘤发生率增加时，可能需要额外的研究（例如免疫表型和功能检测），以确定在暴露于受试物后，免疫系统是否受到损害。

免疫毒性要区分非预期的（不良的）免疫抑制效应和预期的（药效学）效应。比如，抗肿瘤药物对快速分裂细胞具有毒性，这是一个预期的终点，在这种情况下不应被视为不良反应。另一个例子是，如果药物用于治疗实体瘤，由于骨髓毒性导致的免疫抑制被认为是不良事件，但如果药物旨在治疗血液系统恶性肿瘤，则不一定被视为不良事件。

20. 血液学

以下检测项目建议用于评估血液学变化：

血细胞比容、血红蛋白浓度、红细胞计数、白细胞总数及分类计数、平均红细胞血红蛋白量、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白浓度

凝血能力检测（如凝血时间、凝血酶原时间、凝血酶原时间、血小板计数等）

受试化合物可能会影响造血系统，因此应采取适当措施，确保在必要时可以进行网织红细胞计数和骨髓细胞学评估。应使用自动化网织红细胞计数功能或空气干燥血涂片为每只动物进行网织红细胞计数。应为每只动物制备骨髓涂片以评估骨髓细胞学。只有在观察到对造血系统的影响时，才需要对这些涂片进行显微镜检查。

21. 临床生化

应采集血液样本以进行临床化学检测，包括电解质平衡、碳水化合物代谢以及肝肾功能的测量。具体检测项目应包括：

肝细胞评估：至少选择以下五项中的三项，丙氨酸氨基转移酶（SGPT，ALT）；天门冬氨酸氨基转移酶（SGOT，AST）；山梨醇脱氢酶；谷氨酸脱氢酶；总胆汁酸。

肝胆评估：至少选择以下五项中的三项，碱性磷酸酶；胆红素（总）；γ-谷氨酰转肽酶（GGT）；5'-核苷酸酶；总胆汁酸。

其他细胞变化或细胞功能的标志物：白蛋白、钙、氯、胆固醇（总）、胆碱酯酶、肌酐、球蛋白（计算值）、葡萄糖（禁食动物）、磷、钾、蛋白质（总）、钠、甘油三酯（禁食）、尿素氮

然而，如果无法从试验动物中获得足够的血液量，则以下检测项目通常应优先考虑：

丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、氯、肌酐、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、葡萄糖（禁食动物）、钾、蛋白质（总）、钠、尿素氮

22. 尿液分析

应测定尿液量、比重、pH值、葡萄糖和蛋白质，并对尿液进行显微镜检查，以评估尿沉渣和血液/红细胞的存在。

23. 尸检和显微镜检查

大体尸检：所有试验动物应进行完整的肉眼检查，包括检查外部表面、孔口、颅腔、胸腔和腹腔、尸体及所有器官。

器官重量：应称量肾上腺、大脑、附睾、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、睾丸、甲状腺/甲状旁腺、胸腺、卵巢和子宫的重量。应仔细解剖并去除脂肪和其他邻近组织后立即称重，以尽量减少干燥对器官重量的影响。

组织制备用于显微镜检查：组织应在10%缓冲甲醛（或其他公认的固定剂）中固定，并制备切片，用苏木精和伊红（或其他适当染色剂）染色，以备显微镜检查。肺部应在浸泡于固定剂之前用固定剂充气。

显微镜评估：所有肉眼可见的病变应进行显微镜检查。对照组和高剂量组的所有组织应进行组织病理学检查。如果在某些组织中观察到与给药相关的效应，则应检查这些特定组织的下一个较低剂量水平。如果在下一个较低剂量水平中仍观察到效应，则继续检查下一个较低剂量水平，直到未发现效应为止。此外，所有提前死亡或在研究期间被处死的动物的组织应进行显微镜检查，以评估任何潜在的毒性效应。进行组织病理学检查的组织如下：

肾上腺、主动脉、骨（股骨）、骨髓（胸骨）、大脑（至少三个不同水平）、盲肠、结肠、子宫体和子宫颈、十二指肠、附睾、食管、眼睛、胆囊（如果存在）、哈德氏腺（如果存在）、心脏、回肠、空肠、肾脏、肝脏、肺（带主支气管）、淋巴结（一个与给药途径相关，一个来自远端位置）、乳腺、鼻甲、卵巢和输卵管、胰腺、垂体、前列腺、直肠、唾液腺、坐骨神经、精囊腺（如果存在）、骨骼肌、皮肤、脊髓（三个位置：颈椎、中胸椎、腰椎）、脾脏、胃、睾丸、胸腺（或胸腺区域）、甲状腺/甲状旁腺、气管、膀胱、阴道及其它所有异常组织。

24. 供试品分析

若供试品需经溶解后（混合、混悬、溶解）给药，应提供供试品在溶剂中的稳定性、均一性（非溶液体系）等检测报告（浓度范围需能覆盖全部毒理试验的浓度范围），以及配制后的供试品浓度分析报告。

25. 质量保证

方案中通常需要体现质量保证部门介入的内容。

26. 统计分析

统计是判定毒理发现是否有意义的重要工具，故方案中需要明确拟进行统计学分析的指标、统计方法等。

其中，供试品分析、质量保证、统计分析部分在原文中并未包括，笔者根据情况自行添加，仅供大家参考。

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