Adv Sci丨北京大学王杰研究提出整合ACE-tRNA与CRISPR/Cas9技术清除HBV感染的新策略

目前针对乙肝病毒（HBV）的抗病毒药物在实现慢性乙肝的功能性治愈方面仍面临挑战，因此有必要探索新的治疗方法和联合治疗策略。反密码子工程转移RNA（ACE-tRNA）已广泛应用于治疗由无义突变引起的遗传疾病，但其在抗病毒治疗中的作用尚未见报道。

2025年9月12日，北京大学王杰独立通讯在Advanced Science 在线发表题为“Anticodon Engineered Transfer RNA (tRNASUAG) Inhibits Hepatitis B Virus Replication by Promoting the Degradation of Core Protein”的研究论文。该研究设计了ACE-tRNA靶向HBV核心蛋白（HBc）高度保守的终止密码子（UAG）。

所有设计的ACE-tRNA都能读通HBc的终止密码子。其中，tRNASUAG可能通过在HBc的C末端结构域引入可磷酸化的丝氨酸来促进HBc磷酸化，从而可能降低HBc水平并通过泛素-蛋白酶体途径促进HBc降解来抑制HBV复制。此外，ACE-tRNA和CRISPR/Cas9技术可以通过tRNASUAG-gRNA串联阵列有效整合，实现对HBV复制的联合抑制。该研究创新性地利用ACE-tRNA，通过引入一个可能被翻译后修饰的氨基酸来促进HBc降解，从而抑制HBV复制。此外，该研究还提出了一种通过整合ACE-tRNA和CRISPR/Cas9技术来促进HBV感染清除的有前景的治疗策略。

乙型肝炎病毒 (HBV) 感染仍然是全球主要的健康问题。据世界卫生组织统计，全球约有 2.54 亿人患有慢性乙型肝炎 (HBV)，约有 110 万人死于乙型肝炎相关的终末期肝病，包括肝硬化和肝细胞癌。目前的抗乙肝药物，包括核苷（酸）类似物和聚乙二醇干扰素 α，在实现慢性乙肝的功能性治愈方面仍面临挑战。因此，开发新的治疗方法和联合治疗策略对于实现 2030 年消除病毒性肝炎的全球目标至关重要。

乙肝病毒核心蛋白 (HBc) 在乙肝病毒复制中起着至关重要的作用，并具有与重症肝炎相关的细胞病变效应，使其成为治疗乙肝病毒感染及其相关肝病的有希望的靶点。一旦乙肝病毒（HBV）前基因组RNA（pgRNA）从共价闭合环状DNA（cccDNA）转录，HBc就会从pgRNA翻译出来，部分HBc会组装成核衣壳。成熟的核衣壳含有松弛环状DNA（rcDNA），可以分泌到肝细胞外形成病毒颗粒，或被转运到细胞核内补充cccDNA库。目前，靶向HBc组装过程的衣壳组装调节剂（CAMs）已在临床试验中得到广泛探索。虽然CAMs可以有效抑制HBV复制，但它们也存在一定的局限性。例如，出现对CAMs具有抗性的HBV变异株可导致病毒学突破，某些CAMs诱导的肝损伤可导致丙氨酸转氨酶（ALT）水平升高。因此，有必要开发新的低毒性和低耐药性的靶向HBc的方法。

反密码子改造的转移RNA（ACE-tRNA）能够通过修饰天然tRNA的反密码子环，特异性识别指定的终止密码子（UAA-赭石密码子、UAG-琥珀密码子或UGA-蛋白石密码子）。ACE-tRNA能够高效读取功能性蛋白质开放阅读框（ORF）内的提前终止（终止）密码子（PTC），并恢复全长蛋白质的生成。然而，天然终止密码子很难被ACE-tRNA读取。因此，ACE-tRNA在治疗由无义突变引起的各种遗传疾病方面具有良好的潜力，例如β-地中海贫血、囊性纤维化和杜氏肌营养不良症，并且可以通过腺相关病毒（AAV）或脂质纳米颗粒递送。

HBV基因组是约3.2kb的部分双链DNA，含有4个重叠的ORF：C、P、S和X。CORF中的HBc和P ORF中的HBV DNA聚合酶均由pgRNA翻译而来。由于C ORF与P ORF部分重叠，且在C ORF正常终止密码子（UAG）后第6个密码子处存在一个符合读码框的终止密码子（UAA），使得C ORF的正常终止密码子（UAG）在某些方面与PTC相似。因此，ACE-tRNA有可能读穿C ORF的正常终止密码子，这可能是治疗HBV感染的一种潜在方法。虽然ACE-tRNA通过读穿PTC已被广泛应用于治疗各种遗传性疾病，但其在抗病毒治疗中的作用尚未见报道。基于RNA链的二级结构而非特定的核苷酸序列，tRNA的5’前导序列和3’尾随序列在tRNA成熟过程中分别被RNase P和RNase Z切割。这一独特特性使tRNA能够作为多重非编码RNA串联表达的支架。在成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关核酸酶9(Cas9)系统中，tRNA-向导RNA(gRNA)串联阵列已成功在水稻(Oryza sativa)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中实现了多重gRNA的串联表达。然而，在哺乳动物细胞中，tRNA-gRNA串联阵列的研究尚有限。

该研究首先探讨了ACE-tRNA是否能够读取C ORF的终止密码子。然后，探究ACE-tRNA对HBV复制的影响及其潜在机制，并探讨能否通过ACE-tRNA-gRNA串联阵列将ACE-tRNA与CRISPR/Cas9技术有效整合，实现联合抑制HBV复制。

图1 分析针对UAG的ACE-tRNA的读通效率（图源自Advanced Science）

来源：iNature

参考消息：

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202503534