《食品科学》：江苏大学周存山教授等：利用农业-食品生物质废弃物生物转化制备香兰素的研究进展

农业-食品生物质废弃物是地球上储量丰富的可再生资源，来源广泛、价格低廉。农业-食品生物质废弃物主要有谷物加工废弃物、制糖加工废弃物、果蔬加工废弃物、油料加工废弃物、蔬菜加工废弃物、坚果加工废弃物以及其他废弃物如咖啡加工固体废弃物等。从经济和环境角度看，将这些农业-食品生物质废弃物资源化利用，生产高附加值化合物，如具有生物活性的酚类和黄酮类化合物，具有重要意义。农业-食品生物质废弃物主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。其中，木质素是自然界中天然芳香族化合物的重要来源。木质素的绿色、高效分离提取及生物转化为高附加值的天然芳香性产品，如香兰素（图1），是“双碳”背景下构建非石化天然芳香性化学品的重要路径与方案，可为国家食物安全、全球减碳目标、人类可持续发展做出贡献。

香兰素，又称为香草醛、香草素、香兰醛或香茅醛，化学名为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，是全球需求量最大、使用范围最广的香料之一，有“香料之王”的美誉。香兰素在食品行业中应用广泛，常被添加到糕点、冰淇淋、软饮料、巧克力、酒类的制作过程中，发挥增香增味的作用。因其抗菌、防腐特性，香兰素也可应用在食品包装和保鲜中。同时，香兰素具有多种生物活性，对人类健康产生积极影响。

江苏大学食品与生物工程学院的周曼、李诚林、周存山*等利用农业-食品生物质废弃物生物转化制备香兰素，旨在为促进废弃资源利用和保护环境。

01

香兰素的类型及来源

商业香兰素根据其来源可分为天然香兰素和合成香兰素。图2汇总了商业香兰素的主要类型、来源和市场份额。天然香兰素包括两大类，一类是从天然热带植物香荚兰豆中提取，另一类是植物基香兰素。天然提取法获得的香兰素香气自然浓郁，但由于原料供应有限，劳动强度大，易受到自然天气影响，价格昂贵，市场份额仅占1.5%。植物基香兰素是指以农业-食品生物质废弃物（例如麦麸、米糠或木材等），或以阿魏酸、丁香酚、异丁香酚和愈创木酚等为底物，利用生物技术方法获得的香兰素。植物基香兰素满足欧盟和美国对“天然”风味物质的要求，占全球市场份额的10.5%。合成香兰素是指通过化学方法从石油基化学品或工业纸浆废液中获得的香兰素。该方法技术成熟、价格低、产量大，占全球市场的88%，但环境污染大、碳足迹高，不符合绿色化学和可持续的理念，在全球范围内受到食品和制药行业的限制，不符合下游应用市场对天然原料的消费趋势。

传统的方法如植物提取、化学合成等，难以满足天然香兰素的巨大市场需求。香兰素可从廉价底物（如农业-食品生物质废弃物）中通过绿色温和的生物法获得，且被认为是天然香兰素的等同物，受到高端产品市场的青睐。由索尔维（以前称为Rhodia）生产的Rhovanil®是第一种商业上可获得的发酵衍生的香兰素产品，通过将廉价米糠废弃物进行高值转化为香兰素，证明了微生物生产香兰素的商业可行性。随着合成生物学和代谢工程的发展，利用基因编辑技术和DNA重组，定向调控微生物的代谢网络，利用微生物细胞工厂以可再生的农业-食品生物质废弃物为底物生产香兰素成为研究热点。利用微生物从农业-食品生物质废弃物中合成香兰素，具有绿色、安全级别高、高效和可持续等优点，对全球香兰素市场具有重要意义。

02

农业-食品生物质废弃物转化为香兰素的生物合成路径

2.1 “生物漏斗”式木质素的生物转化合成香兰素路径

利用可再生的农业-食品生物质废弃物为原料合成香兰素可以降低香兰素的生产成本，具有很高的经济前景，极具研究价值。微生物作为生物催化剂能够将农业-食品生物质废弃物中的木质素组分转化为高值化产品，如香兰素。这种生物催化潜能源自其木质素降解酶，如漆酶和染料脱色过氧化物酶（DYP），它们具有分解多种芳香化合物的能力，并且这些微生物通过“上通道”（芳香化合物代谢途径）转化为有限的中间产物，然后通过“下通道”（环裂解途径）进入中心碳代谢，这一过程被称为“生物漏斗”。微生物通过“生物漏斗”途径可以通过多条木质素代谢途径将不同的木质素解聚成酚类化合物，并汇集到一个共同的或有限的中间代谢产物，从而实现从木质素到单一化合物的高效转化。“生物漏斗”是农业-食品生物质废弃物综合利用和高值转化的基本技术之一。这种“生物漏斗”法为现代生物质精炼厂克服木质素解聚过程中非均质性问题提供了一种直接的生物解决方案，极大地简化了下游目标产物的分离。

由于木质素结构的复杂性和多样性，经预处理后获得的木质素衍生化合物一般是对香豆醇（H型）、松柏醇（G型）和丁香醇（S型）化合物的混合物。农业-食品生物质废弃物中G型木质素类化合物的含量显著高于H型和S型。这些木质素衍生化合物一般通过“生物漏斗”途径进行代谢，如图3a所示。一些微生物能够降解G型和H型木质素化合物。例如，红球菌（Rhodococcus jostii）RHA1可分泌DYP，降解木质素中的β-芳基醚键，继而转化为香兰素，嗜碱耐盐菌（Bacillus ligniniphilus）L1在以木质素为碳源的培养基中编码漆酶的基因显著上调，漆酶促进木质素中β-O-4等单元键的断裂，且可将降解产物香草乙酮转化为香兰素。G型和H型木质素单体，如阿魏酸、香兰素、香草酸、愈创木酚和香豆酸通过一系列酶促生化反应合成原儿茶酸，并进一步代谢进入三羧酸循环。S型木质素类化合物如丁香酸可以降解成为没食子酸进一步通过β-酮己二酸途径转化为琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A等进入三羧酸循环等。

除木质素外，农业-食品生物质废弃物中的其他组分即纤维素和半纤维素也可作为微生物合成香兰素的底物，促进香兰素生物合成的碳通量。如图3b所示，天津大学合成生物学前沿科学中心李炳志和元英进院士团队利用了一种创新的人工生物漏斗途径（ABFP），在酿酒酵母中使用组合工程策略建立了生产香兰素的人工途径，将农业-食品生物质废弃物中木质素、纤维素和半纤维素的降解产物，如阿魏酸、对香豆酸、葡萄糖，转化为香兰素，实现了玉米秸秆的全组分的高值化利用。厦门大学袁吉锋教授团队通过3 条策略工程改造酿酒酵母为生产香兰素的底盘细胞，以葡萄糖为原料从头合成香兰素，如图3c所示。首先，敲除了酿酒酵母中12 个内源性氧化还原酶基因，使得工程改造后酿酒酵母具备较好的香兰素积累能力。其次，在香兰素积累菌株中整合表达3-脱氢莽草酸脱水酶（3DSD）介导的香兰素合成路径，同时通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）和甲基供体优化以减少中间体原儿茶酸的累积，进一步提高香兰素的含量。最后，引入磷酸酮酶和磷酸转乙酰酶来提高前体的供应，重塑中心代谢路径。最终，香兰素产量达（365.55±7.42）mg/L，是目前微生物以葡萄糖为碳源合成香兰素的最高产量。

2.2 香兰素的生物合成路径

目前，研究人员构建了以木质素衍生化合物（如阿魏酸、松柏醇、丁香酚、异丁香酚、香草醇和对香豆酸）以及纤维素和半纤维素衍生化合物（如葡萄糖）为前体的合成香草醛的“生物漏斗”路线，如图4a、b所示。

2.2.1 以阿魏酸为底物的香兰素合成路径

阿魏酸是一种重要的木质素单体，在自然界中大量存在，常见于农业-食品生物质废弃物中，例如麦麸和米糠。阿魏酸由于其低毒、储量丰富和转化效率高，被认为是微生物合成香兰素的最佳底物。如图4a所示，微生物通过5 种不同的途径利用阿魏酸合成香兰素：1）不依赖辅酶A的非β氧化；2）依赖辅酶A的去乙酰化；3）依赖辅酶A的β氧化；4）非氧化脱羧；5）侧链还原。辅酶A依赖途径主要由FCS和ECH参与催化过程。FCSECH是阿魏酸合成香兰素的主要合成途径。然而，在这种生物合成途径中对ATP和辅酶A的持续需求严重阻碍了香兰素的合成效率。因此，研究人员构建了一个非辅酶A依赖的人工合成途径，由两个非辅酶A依赖的酶组成：FDC和类胡萝卜素裂解加氧酶（CCO）CSO2。在该途径中，阿魏酸被FDC脱羧生成4-乙烯基愈创木酚，FDC催化芳香羧酸的非氧化脱羧，4-乙烯基愈创木酚通过CSO2利用氧气进一步转化为香兰素。孟永红等构建了一株重组拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）菌株，在该重组菌株中表达了基因fdc和cso2，该路径无需辅酶A和ATP作为辅酶参与反应，为工业生产进一步提高香兰素的发酵产量提供技术支撑。然而，在此路径中，CSO2活性低，限制了香兰素的合成效率。因此，为了不依赖ATP和辅酶A，Ni Jun等设计了一种含有新型的酚酸脱羧酶和ADO无辅酶生物催化剂，以不依赖辅酶的方式实现木质素的高值化利用，并且提出一种新的温度和pH值导向策略来进一步消除内源性ADH的高活性，进而提高香兰素的积累，大大提高了效率，并节约了成本。

2.2.2 以其他木质素衍生化合物为底物的香兰素合成路径

丁香酚是一种工业合成工艺简单、生产香兰素效率高且易得的原料。尽管从丁香酚生产的生物基香兰素产量不到1 g/L，但由于其强烈的香气和高安全性，受到高端食品和饮料市场的欢迎。如图4a所示，丁香酚经EHY A/B转化为松柏醇，随后被CAL A转化为松柏醛，进而继续被CAL B转化为阿魏酸，后通过阿魏酸的多条代谢途径合成香兰素。王晶等构建了一种以丁香酚为底物高产香兰素的重组型拟无枝酸菌工程菌株，该重组菌株含有CAL A/B编码基因，能够以丁香酚为底物发酵产香兰素，在5 L发酵罐中发酵可产生20.2 g/L香兰素。

异丁香酚是丁香酚的同分异构体，价格低廉（约50 USD/kg），是生产香兰素最有潜力的原料之一。在细菌和真菌中，异丁香酚通过环氧化物-二醇途径生物转化为香兰素。此路径中的关键酶是IEM，IEM将异丁香酚的侧链氧化生成环氧异丁香酚，随后转化为中间体异丁香酚二醇，最后转化为香兰素。针对现有IEM稳定性差和活力低的问题，Zhou Rui等筛选获得一个来自松针刺盘孢菌（Colletotrichum fioriniae）的IEM，与现有IEM序列同一性较低，且对异丁香酚显示出高活性，从异丁香酚到香兰素的转化率高于90%；何亚斌等通过定向进化，获得活力提高2～4 倍的IEM突变体，提高了IEM催化异丁香酚合成香兰素的效率。此外，CCO也可将异丁香酚转化为香兰素，这是因为CCO拥有与IEM相似的氨基酸序列。与从丁香酚合成香兰素途径相比，从异丁香酚合成香兰素的途径更为简短，所以异丁香酚作为前体比丁香酚更具有优势。

香草醇也可以作为香兰素的底物，被香草醇氧化酶（VAO）或EUGO氧化成香兰素。EUGO可以固定在琼脂糖凝胶、环氧琼脂糖凝胶、MIDA镍等载体上重复使用，在提高香兰素产量的同时，降低了生产成本，使得该路径更接近工业化实施。此外，其他木质素降解产物，如4-乙基愈创木酚、4-正丙基愈创木酚、4-甲基愈创木酚、香草酸和反式阿魏酸，也可作为合成香兰素的底物。研究发现，4-乙基愈创木酚中的共轭双键可以被CSO2催化氧化裂解；4-正丙基愈创木酚可被EUGO选择性脱氢形成异丁香酚，然后进入香兰素合成途径；巨大芽孢杆菌（B. megaterium）OMK-72可将4-甲基愈创木酚氧化转化为香兰素，产量可达16.2 g/L；霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）DQ可有效利用反式阿魏酸生产香兰素，并且该菌株有良好的阿魏酸与香兰素耐受性。

2.2.3 以葡萄糖为底物的人工合成香兰素路径

除了木质素及其衍生化合物外，农业-食品生物质废弃物中另一个主要的成分是由葡萄糖组成的纤维素。葡萄糖是农业-食品生物质废弃物预处理后的主要成分之一，是微生物发酵的极好来源，是一种安全且便宜的碳源。然而，没有证据支持野生型微生物将葡萄糖直接转化为香兰素。研究人员通过引入香兰素的天然生物合成路径，成功地构建了重组大肠杆菌和酿酒酵母底盘细胞，以葡萄糖为底物生产香兰素，产量分别为119、45 mg/L和481.2 mg/L。以葡萄糖为底物的香兰素生物合成途径源于莽草酸途径，如图4b所示。葡萄糖经糖酵解和磷酸戊糖途径分别生成E4P和PEP，随后E4P和PEP进入莽草酸途径，经过一系列反应后生成3-DHS，最后转化为酪氨酸和其他芳香族化合物。其中，3-DHS和酪氨酸是香兰素的前体物质，进入香兰素合成途径。3-DHS经3DSD合成原儿茶酸，在COMT催化下生成香草酸，继而在ACAR作用下生成香兰素，或经过ACAR作用生成原儿茶醛，最后在COMT的甲基化作用下生成香兰素。酪氨酸被TAL通过非氧化脱氨作用转化为对香豆酸，继而被对C3H转化为咖啡酸，咖啡酸被COMT转化为阿魏酸，最后阿魏酸经FCS-ECH路径转化为香兰素。然而，该路线需要腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，另外需要ATP和NADPH作为辅因子还原香草酸合成香兰素，在一定程度上限制了以葡萄糖为底物合成香兰素的效率，导致产量很低。

2.3 香兰素分解代谢路径

香兰素的分解代谢路径如图4c所示。香兰素被微生物中的一系列酶转化为多种代谢副产物，如香草酸和香草醇。香兰素被VDH氧化为香草酸，随后香草酸可能会经历3 条路径进一步被代谢为其他化合物：1）香草酸被VAN A/B转化为原儿茶酸，并进一步代谢进入三羧酸循环；2）香草酸被VDC B/C/D脱羧形成愈创木酚；3）香草酸被香草羟化酶脱羟基化为甲氧基对苯二酚。此外，香兰素可能被氨基化形成香草碱，或是被内源性ADH还原形成香草醇。因此，研究人员采取重建代谢途径、阻断或削弱竞争代谢支路、减少香兰素所需前体物的消耗等策略，有效地引导碳通量流向香兰素，平衡代谢通量，提高香兰素的合成量。

03

以农业-食品生物质废弃物为底物生产香兰素

在香兰素的生物转化发酵工艺中，廉价、可再生的替代底物的使用越来越受到关注。农业-食品生物质废弃物，如甘蔗渣、小麦秸秆、麦麸、石榴皮等，是香兰素转化底物如阿魏酸、丁香酚、异丁香酚的重要来源。以农业-食品生物质废弃物为底物生产香兰素具有经济、绿色、低碳、可持续等优势。图5为利用农业-食品生物质废弃物为底物生产香兰素的流程示意图。农业-食品生物质废弃物经适当的预处理技术破坏其异质性和抗降解屏障，释放出香兰素合成前体物质（如各种G型木质素衍生物），然后利用天然或基因工程改造的微生物，经过其特有的“生物漏斗”代谢路径，在合适的发酵条件和发酵设备中生物合成香兰素，随后经树脂或膜分离纯化后获得高纯度的香兰素，可作为增香剂、防腐剂、保鲜剂等应用到食品行业中。

一些微生物天然地具有利用农业-食品生物质废弃物少量合成香兰素的能力。如表1所示，许多真菌、乳酸菌和放线菌具有以农业-食品生物质废弃物为底物生物合成香兰素的能力。但是，由于野生菌株存在转化效率低、降解速率高和产物细胞毒性等问题，难以大规模生产。为解决这些问题，已经采用了诸如菌株筛选、物理和化学诱变和实验室进化之类的方法来实现代谢路径的优化。由于天然宿主的未驯化特性，例如外源DNA的转化效率差，使其难以进行基因工程改造。另一种方法是探索传统模型宿主（如大肠杆菌和酿酒酵母）在生物转化生产香兰素中的潜力。借助多组学技术，例如基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学，认识和理解香兰素代谢网络，阐明香兰素对微生物产生毒性的机制。通过应用合成生物学、代谢工程和酶工程等方法，构建香兰素人工合成途径，重塑底盘细胞的代谢通路，改善重组底盘细胞的性能，提高香兰素产量。

3.1 菌株筛选及培养条件优化

一些微生物可以天然地以农业-食品生物质废弃物为底物生物合成香兰素。例如，有研究学者组合使用黑曲霉（A. niger）和朱红密孔菌（P. cinnabarinus）两种真菌，采用两步发酵法以多种农业-食品生物质废弃物为原料，如甜菜渣、玉米麸皮和米糠油，生产香兰素。如图6a所示，首先，利用A. niger分泌的包括阿魏酸酯酶（FAE）在内的多种多糖降解酶从农业-食品生物质废弃物中释放阿魏酸，并进一步将其转化为香草酸，再通过P. cinnabarinus将香草酸还原为香兰素。根据此两步法，Rejani等组合使用A. niger和黄孢原毛平革菌（P. chrysosporium）两种真菌利用椰糠中生产香兰素。A. niger先将椰糠中的阿魏酸转化为香草，然后香草酸在P. chrysosporium作用下还原为香兰素（0.773 g/L）。

除了组合使用多种微生物外，也可以单独使用具有FAE活性的微生物，例如有些乳酸菌和放线菌（表1）。这些微生物先利用FAE将农业-食品生物质废弃物中的阿魏酸从阿魏酸酯中释放出来，进而再利用自身的香兰素天然合成途径合成香兰素。如图6b所示，研究发现山南链霉菌（S. sannanensis）MTCC 6637可以合成FAE，将农业-食品生物质废弃物中的阿魏酸酯分解成阿魏酸，随后阿魏酸在内源性酶FCS和ECH的作用下经过辅酶A依赖的非β氧化路径将其转化香兰素；嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）MTCC 10307具有较高的FAE活性，可以从每克甘蔗渣中释放出275 mg的阿魏酸，然而，该菌株只能合成15 mg的香兰素，表明该菌需要进一步优化香兰素的合成路径以提高香兰素产量。此外，研究发现木质素降解菌，如节杆菌Arthrobacter sp. C2、B. ligniniphilus L1和R. jostii，可以分泌木质素降解酶，将木质素降解为小分子芳香化合物，进一步氧化为香兰素。例如，Arthrobacter sp. C2可以分泌DYP，将木质素中的G结构单元转化为香草醇，香草醇继而被VAO氧化生成香兰素。

为解决香兰素转化效率低、降解速率高和细胞毒性高等问题，研究者通过香兰素耐受菌株选育及适应性进化、发酵条件优化、分批补料发酵、膜选择性过滤和树脂吸附香兰素等策略促进香兰素产量的提升。Chakraborty等通过阿魏酸富集策略从乳制品样品中筛选获得一株天然乳酸片球菌——P. acidilactici BD16，具有较低的VDH活性和优异的香兰素耐受性（5 g/L）。乳酸菌是GRAS状态微生物，进一步保障了其生物转化获得的香兰素在食品等领域中直接应用的安全性。Lyons等使用甲磺酸甲酯化学诱变获得多株Amycolatopsis sp.突变型菌株，具有以高产率且无任何滞后时间段产生天然香兰素的能力。通过对Amycolatopsis sp. ATCC 39116野生菌进行4 轮适应性进化，Tupe等将香兰素的得率提高了30%～35%。这是因为适应进化触发了阿魏酸分解代谢途径（特别是FCS和ECH），提高了阿魏酸同化和转化为香兰素的效率。Chattopadhyay等通过响应面优化发酵麦麸添加量、温度、pH值和搅拌速度等因素，利用S. sannanensis MTCC 6637直接从麦麸中产生708 mg/L的香兰素。Mehmood课题组通过优化固态发酵中的水分含量、发酵时间、接种量、发酵温度和时间等参数，提高E. hormaechei从石榴皮和甘蔗渣生产香兰素的产量，利用S. sannanensis MTCC 6637从每克小麦秸秆中获得了2.74 mg的香兰素。Paul等利用阿氏芽孢杆菌（B. aryabhattai）NCIM 5503深层发酵从椰糠中生产香兰素，通过响应面优化发酵温度、pH值和金属盐添加量等因素提高香兰素产量，在最优条件下，每克椰糠可以产生5.28 mg的香兰素。Saeed等利用碱液从石榴皮中提取阿魏酸，在最佳深层发酵条件下，E. hormaechei可以在8 h内产生4.2 g/L的香兰素。Liu Sichang等使用工程酿酒酵母作为全细胞生物催化剂，结合原位分离，成功地将真正的木质素水解产物转化为香兰素（21.1 mmol/L），相当于每克麦麸生物质可产生1.8 mg香兰素。

由于农业-食品生物质废弃物中木质素的高度聚合和抗降解屏障，预处理是必要的环节之一。常见的预处理技术包括酸/碱溶液水解、低共熔溶剂预处理、水热预处理、超声/微波辅助处理、酶预处理等。通常，以农业-食品生物质废弃物为底物，通过生物转化获得香兰素的路线由两步组成：首先，利用预处理手段将农业-食品生物质废弃物中的阿魏酸或其他木质素衍生化合物分离提取出来，然后，利用微生物将这些化合物通过生物转化获得香兰素。Tang Peiling等首先通过碱提取法从菠萝废弃物中提取阿魏酸，通过响应面优化碱液提取条件提高阿魏酸的提取率，然后利用A. niger I-1472将阿魏酸转化为香兰素。作者对比了两种补料模式，发现大体积补料比小体积补料可产生更多的香兰素。此外，研究发现，在碱液提取阿魏酸后，使用大孔树脂来纯化阿魏酸提取液可显著提高香兰素的得率。Macronet® MN102可以去除玉米秸秆水解液中对Amycolatopsis sp. ATCC 39116细胞生长产生抑制作用的物质，例如有机酸、金属和一些醛类等。李炳志等使用工程酿酒酵母以阿魏酸和/或木质素为底物生产香兰素，利用壳聚糖分子中的氨基与香草醛的醛基发生席夫碱反应，把香兰素从反应体系中移除，有效地降低了对细胞的毒性，明显提高了香兰素的产量。

3.2 代谢工程促进香兰素产量提升

随着生物信息学的高速发展，研究人员对香兰素合成途径及关键基因有了较为清晰的认识，通过代谢工程改进自然底盘细胞的香兰素合成途径，进而促进了香兰素产量的提升。通过基因组和转录组分析B. ligniniphilus L1的代谢途径，Zhu Daochen等揭示了其降解木质素和木质素衍生化合物的能力。B. ligniphilus L1中基因vdh的缺失阻断了香兰素的分解代谢，并通过优化预处理方法，香兰素产量进一步提高到352 mg/L。最后，开发了一种“chassis cell milking”技术消除香兰素的细胞毒性，实现了B. lininiphilus L1可持续生产香兰素。为提高香兰素的产量，Sainsbury等敲除了R. jostii RHA1中vdh基因，发现该重组菌株在含有2.5%小麦秸秆和0.05%葡萄糖的最低培养基上生长144 h后，香兰素产量达96 mg/L。Chakraborty等在P. acidilactici BD16中外源表达编码FCS和ECH的基因，构建了重组菌株P. acidilactici BD16 (fcs+/ech+)，将香兰素产量从1.06 g/L提高至4.01 g/L。如图6c所示，Zhao Xinyue等通过敲除编码苯甲醛脱氢酶基因xylC，过表达编码VAO的基因pchF，构建了重组Arthrobacter sp.KN2689工程菌。该工程菌可直接利用玉米秸秆中的碱木质素作为底物生产香兰素。

在已经公开的现有技术中，Amycolatopsis sp.被公认是现有已知微生物中利用阿魏酸转化为香兰素能力较强的微生物。全基因组测序发现，Amycolatopsis sp.CCTCC NO: M2011265基因组中蕴含香兰素合成关键基因ech、fcs和ech2，及香兰素分解代谢基因vdh。摇瓶发酵结果表明，过表达ech-fcs-ech2菌株生成香兰素速率加快，发酵时间显著缩短。郑义培等建立适用于Amycolatopsis sp.的CRISPR-Cas9基因编辑系统，敲除vdh基因，减少发酵副产物香草酸。调控蛋白基因tyrR1和丙酮酸激酶基因pyk的缺失，分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶基因tyrA、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶基因aroF和磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsA的过表达，构建重组Amycolatopsis sp.菌株，将以葡萄糖为底物发酵产香兰素的产量提高至4.72 g/L。

为应对与天然底盘细胞相关的挑战，另一种策略是使用常见表征良好的菌株开发重组底盘细胞，如重组大肠杆菌和酿酒酵母。这些模式生物拥有完善的代谢网络和高效的基因编辑系统，使其更适合基因工程。构建重组底盘的初始步骤涉及将所需的生物合成途径引入宿主细胞、重新连接新的代谢途径以提高生产性能，包括提高对产物和底物的抗应变性以及消除副产物的形成。兰佳鑫构建了重组大肠杆菌，以农业-食品废弃物为原料，通过微生物转化法释放其中的阿魏酸并进一步转化为香兰素。如图6d所示，该重组大肠杆菌既包含了由基因fae和xyn组成的阿魏酸释放模块，又包含了由基因fcs和ech组成的香兰素合成模块。结合水热预处理、稀磷酸预处理、外源添加商业纤维素酶及木聚糖酶协同发酵等处理措施，开创了重组大肠杆菌直接利用农业-食品生物质废弃物高效合成香兰素的工艺。当重组大肠杆菌以菠萝皮、玉米芯、菠萝冠叶为底物时，香兰素产量分别可达580.55、540.94 mg/L和520.24 mg/L。天津大学李炳志教授和元英进院士团队组合使用多种合成生物学和代谢工程策略来调节香兰素的合成，将农业-食品生物质废弃物的全组分在重组酿酒酵母中生物转化为香兰素。如图6e所示，首先对香兰素的关键分枝代谢途径进行了寻找和阻断，敲除了酿酒酵母中编码内源性氧化还原酶的基因（如vdh）并引入vao基因，降低了副产物香草醇的积累，构建了一个香兰素稳定性较高的酿酒酵母底盘。然后，通过引入3dsd和tal基因，构建葡萄糖从头合成香兰素途径，同时引入4cl、ech和comt基因，构建以阿魏酸和对香豆酸为底物的香兰素合成途径。最后，通过蛋白融合、SAM代谢调控、代谢途径优化等多种调控策略成功地促进了酿酒酵母中香兰素的生物合成。以玉米秸秆生物质的真实全组分水解液为发酵基质，发酵72 h后，重组酿酒酵母yVAN057菌株产生10.5 mg香兰素/g碳源，是酿酒酵母利用玉米秸秆水解液生产香兰素的最高产量。Pattrick等通过蛋白质组学分析确定了耐药结节分化（RND）家族外排基因acrD和芳香酸外排蛋白（AaeA和AaeB）与大肠杆菌中香兰素抗性和细胞毒性的关系。以上这些发现和尝试为高产香兰素底盘细胞的开发提供了理论和技术参考。

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结 语

能源短缺、资源匮乏和环境污染已成为世界性难题，利用廉价、可再生的农业-食品生物质废弃物生物转化制备香兰素成为有效的解决途径之一。近年来，人们对香兰素的重大工业意义和天然合成途径的理解不断深入，伴随着合成生物学和生物信息学的蓬勃发展，以合适的微生物作为底盘细胞通过“生物漏斗”的方式合成天然香兰素成为经济、绿色、低碳、可持续的选择。然而，该领域仍然面临着一些挑战：1）香兰素的市场应用潜力仍受到石油衍生产品低成本的挑战，农业-食品生物质废弃物中木质素的复杂和非均相性质、转化选择性有限以及工艺产率极低，仍然阻碍了香兰素的高效转化；2）微生物底盘代谢网络的复杂性，使得合成途径的理性设计和优化成为香兰素合成生物学的主要难点之一；3）芳香族化合物毒性仍然是一个持续性的挑战，进一步优化来提高重组菌株的耐受性对于工业化生物转化制备香兰素无疑十分重要。

针对以上问题，可以从以下几个方面着手予以解决：1）开发高效的预处理策略，例如使用绿色、安全的低共熔溶剂代替传统的化学试剂，获得有利于香兰素生产的木质素级分；优化发酵工艺条件、调整补料策略，使用静息细胞的全细胞催化及酶固定化等；在工艺优化和设备升级的同时，着力降低在运输和储存方面的成本。此外，从经济、技术和环境角度开发木质素高值转化为香兰素的生命周期评估模型，进一步提高商业可行性和技术经济性。2）利用先进的合成生物学、代谢工程、酶工程和多组学技术，借助人工智能、机器学习等辅助路径设计、辅因子工程、微调基因表达水平等策略，利用生物传感器高效识别突变体，借助酶生物勘探与酶工程挖掘并改造对香兰素具有高选择性和高活性的酶，开发新型代谢调控工具以及对天然和非天然途径的重塑，阻断或削弱竞争代谢支路，强化前体物质合成，引导碳通量的流速和流向，构建具有高效香兰素生物合成途径的重组工程菌株，尤其是构建GRAS菌株（例如乳酸菌和食品级毕赤酵母），进一步提高香兰素的安全性。3）筛选和驯化获得对香兰素毒耐受性的菌株；解析耐受转录因子调控机制，对关键基因进行精细调控；对香兰素的醛基进行羟化或糖苷化修饰，降低香兰素的细胞毒性；构建智能传感器，在线监测香兰素的含量，开发用适用于香兰素提取纯化的技术，建立反应分离耦合系统，及时实现香兰素的分离，进一步提高香兰素的产量。总而言之，随着合成生物学的发展，先进技术和工具的出现势必会加速高效细胞工厂的开发，必将实现香兰素的低成本工业化生产。

本文《利用农业-食品生物质废弃物生物转化制备香兰素的研究进展》来源于《食品科学》2025年46卷第2期248-259页，作者：周曼，李诚林，林凯琳，陈鲁易，王子怡，杨欣颖，蒋海燕，章晓雪，黄晓琪，周存山。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240605-022。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为进一步促进动物源食品科学理论的完善与创新，加速科研成果向实际生产力的转化，助力产业实现高质量、可持续发展，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、中国食品杂志社将与江西农业大学、江西科技师范大学、 南昌师范学院、 家禽遗传改良江西省重点实验室 共同举办的“ 2025年动物源食品科学与人类健康国际研讨会 ”，将于 2025年10月25-26日 在 中国 江西 南昌 召开。

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北京食品科学研究院、中国食品杂志社和全国糖酒会组委会将于2025年10月16-18日在江苏省南京市南京国际博览中心举办第113 届全国糖酒会食品科技成果交流会。食品科技成果交流会期间举办食品科技成果展，本届科技成果展以我国当前食品产业科技需求为导向，重点邀请“十四五”以来获得国家和省部级重要科研项目支持产出的食品科技新成果、新技术、新产品参展，并针对企业技术需要开展精准对接服务。

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