关于中药含药血清，你想知道的都汇总好了，请查收！涉及动物选择、给药方式和采血时间怎么确定

情景重现

中医药科研项目正在快速发展，但因为中药成分复杂，一般SCI发表都会要求对中药进行成分表征，或做中药原液、或检测入血成分，以确定可能发挥药效的物质基础。

那么，如何来制备中药的含药血清，血清中的成分又是用什么方法检测呢？我们本次将前期的一些推文汇总，向大家汇报：

1.

1.1实验动物的选择

采用正常动物或模型动物的血清均有，并且采用健康正常动物应尽量与模型动物一致。因此，选择健康动物还是模型动物需要进一步探讨。

1.2给药方案的选择

（1）给药剂量：若将含药血清看作一种药物，那么给药剂量取决于2 个方面：一是动物给药量，二是培养体系或反应体系中含药血清浓度。动物给药量换算公式为给药剂量＝人临床用量×动物等效剂量比值×培养液中血清稀释度，如果是做入血成分分析，可以适当提高给药剂量（5-10倍临床剂量换算）。

（2）给药、采血时间：目前有几种经验给药方案：1）7～10 d 给药法（每天 1 次，连续给药 7～10 d）；2）3 次给药法（连续 3 次，第 1、2 次间隔 20 h，第 2、3 次间隔 4 h）；3）2 次给药法（第 1 次给药后 2 h，再以相同剂量重复给药 1 次）等。采血时间一般在末次给药后 0.5～3 h，一般不超过 6 h，采血时间过早，部分药物组分未被吸收入血；采血时间过长，部分药物组分在体内发生转化或被排泄掉，理想的采血时间应落在药物达到稳态血药浓度期间。

1.3血清的处理

大部分研究人员对含药血清采用 56 ℃水浴加热 30 min的灭活方式，可以除去血清本身含有的补体等干扰实验的活性成分；也有研究人员将含药血清经乙醇、丙酮等有机试剂处理，通过使蛋白质变性去除血清中的酶、激素等，从而保留药物本身的作用。

具体可见往期公众号推文：《

2.中药含药血清制备及成分鉴定流程：

制备流程见下图：

看了流程图，下面我们再来学习下入血成分-代谢组检测相关的实验方法：

1.从血清样品中提取代谢物

血清样品在4°C下解冻后，将200μL血清与预冷却的800μL甲醇混合，并将上清液在4°C下以20000 g离心10分钟。上清液通过0.22μm滤膜过滤，获得待测样品。

2.UHPLC-MS/MS的色谱和质谱条件

使用Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC和ACQUITY UPLC T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm），自动进样器温度为8°C，流速为0.3 mL/min，柱温为50°C。用2μL的进样体积洗脱样品。流动相由0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）组成。梯度洗脱程序为0-0.8min，2%b；0.8-2.8分钟，2%-70%B；2.8-5.6分钟，70%-90%B；5.6–8分钟，90%–100%；8-8.1分钟，100%-2%b；8.1–10分钟，2%b。Thermo Q Exactive Focus质谱仪在以下条件下运行：电喷雾离子（ESI）源、正负离子模式、正离子喷雾电压4.00 kV、负离子喷雾电压3.00 kV、鞘气体35 Arb、辅助气体10 Arb、毛细管温度320°C、全扫描分辨率70000、扫描等离子体芯比范围70–1050、HCD二次裂解、，碰撞电压为30eV。

3.数据处理

使用MassHunter Profider软件（版本B.06.00；美国加利福尼亚州圣克拉拉市，安捷伦）提取样本数据进行分析和比较。根据人类代谢组数据库（HMDB）和METLIN的精确分子量确定了潜在的生物标志物(http://metlin.scripps.edu/)数据库。通过MetaboAnalyst 4.0进行代谢途径富集分析(http://www.metaboanalyst.ca/)网站。

本次推文再分享：文章Feiyiliu Mixture sensitizes EGFRDel19/T790M/C797S mutant non-small cell lung cancer to osimertinib by attenuating the PRC1/Wnt/EGFR pathway

3.含药血清制备，如何判断质量可靠！

3.1.肉眼观察一般情况：我们可以采用不同品系的动物制备血清/血浆，给完药取血后，不溶血的情况下，应该是如下：一般血清是略偏黄色，如果变红那可能就是有点溶血，但是轻微溶血对于成分鉴定和细胞实验是没有影响的。

3.2.开展入血成分鉴定：如果肉眼观察无异常后还是不放心，那就做液质联用成分鉴定，看看是否含有自己方子里面的成分。

4.中药成分及入血成分如何检测

中药作为多组分复杂体系，具有成分繁多、结构多样、含量差异大、异构体丰富等特点，定性分析面临着很大的挑战。传统色谱技术（薄层色谱、液相色谱等）的本质是利用各成分在流动相和固定相中的分配能力差异而表现出的不同分离特性（薄层色谱为比移值Rf = 溶质移动的距离/溶液移动的距离，气相色谱和液相色谱为保留时间Rt）。当色谱分离条件固定时，上述分离特性为固定值，因此可通过与对照品的Rf或Rt值进行比较，判断样品是否含有某一化合物。此类方法具有设备价格相对较低、操作简单、结果易读等特点，因而广泛用于中药材及饮片、中成药、中药提取物等的质量控制。然而，上述方法需要通过与对照品进行比对才可对化合物进行定性，因此，对未知成分的定性能力很差，无法满足当前全面阐明中药化学组成的需求。

2020年，国家药监局发布《关于促进中药传承创新发展的实施意见》，明确提出要“引入新工具、新方法、新技术”，深入挖掘中医药宝库的科学内涵。液相色谱-高分辨质谱联用技术不仅兼顾了色谱分离特性，还增加了质谱维度信息（母离子质荷比、子离子质荷比、同位素分布）等，极大提高了鉴定结果的准确度，避免了常规色谱定性因保留时间相同导致的假阳性；此外，可通过母离子质荷比、子离子质荷比等信息对无对照品的化合物进行定性，因而极大拓展了常规色谱技术对未知成分的定性能力，定性结果往往可达到100+。

这里我们分享一篇phytomedicine文章：Integrated serum pharmacochemistry and network pharmacology toexplore the mechanism of Yi-Shan-Hong formula in alleviating chronicliver injury（血清药物化学与网络药理学相结合探讨Yi-Shan-Hong formula减轻慢性肝损伤的作用机制）

本文采用专业的液质技术，将中药成分和入血成分进行鉴定，汇总表格包含了成分、荷质比、碎片m/z、成分归属等。

与一般非靶的方式做中药成分鉴定或入血成分不同，目前发2区以上文章，我们建议采用专业中药自建数据库，并进行分析。

中药成分分析是中药物质基础的重要组成部分，目前以网药、生信、组学为桥梁研究作用机制的高分思路，均需要中药成分鉴定为基础。

1).中药药效物质筛选；

2).确定中药质量标志物；

3).以入血成分或中药成分鉴定为基础的网络药理；

4).代谢组学分析筛选途径靶点；

。。。。。。

5.如何确定中药成分是否是有效成分

这里要告诉您一个事实，那就是做成分鉴定是不能确定有效成分。只能说明该中药提取物里面含有这些成分。这些成分可以作为中药发挥药效的预测，就是可能是发挥作用。您可以通过网药预测，或者进一步做入血成分确定其中的可能的有效成分。

那如何确定中药成分的有效性：

1.根据成分鉴定的结果，然后结合文献，确定某个成分是否对研究的疾病有效；

2.做细胞或动物实验筛选有效物质；

3.采用生信（网络药理）或组学（代谢组学）的方法，预测可能的有效成分或代谢物，找到有效标志物。

还是把这张图放上，或许对您有些启发~

6.入血成分鉴定、含量测定、指纹图谱与非靶代谢组的区分

入血成分鉴定：通过UPLC-MS/MS等方式比较中药原液与动物给药后的含药血清中成分，确定哪些成分是入血前后都有的单体成分。

非靶代谢组：与入血成分鉴定的方法相似，通过UPLC-MS/MS等方式比较中药原液与动物给药后的血清、尿液、粪便、组织中的成分，并通过比对公共数据库，进行富集分析，获得通路途径。

含量测定：相关公司叫做靶向代谢组检测；这个主要就是采用液相或者液质，对已知的成分购买标准品，制作标准曲线，并摸索流动相比例，将目标成分分离度调整好，最终确定中药液或者含药血清等样本里面的成分多少，是一个明确的含量值，有单位。

指纹图谱：指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段（如液相、液质等），得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。主要原则是系统性、特征性、稳定性。有的研究会用到：中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以计算相似度等。

7.中药成分及入血成分鉴定找谁做：

相关咨询，加微信：1278317307。

中医药基础科研服务：

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