柯萨奇病毒A组16型灭活疫苗（Vero细胞）抗原定量检测方法的建立及应用

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中文摘要

目的建立柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CV-A16）抗原ELISA定量检测方法，用于CV-A16疫苗中抗原的定量检测。

方法以兔抗CV-A16多克隆抗体为包被抗体、辣根过氧化物酶标记的鼠抗CV-A16单克隆抗体为检测抗体，建立CV-A16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA，确定该方法的线性范围，并进行准确度、精密度、专属性及耐用性验证。用该方法检测CV-A16疫苗原液以及生产工艺各中间样品的CV-A16抗原含量，考查方法的适用性。

结果建立的ELISA方法线性范围为3.125~400.000 U/mL，决定系数在0.983 9~0.991 3，表明该方法线性良好；检测不同浓度的CV-A16国家抗原标准品，回收率在80%~120%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）≤11%，准确度良好；不同抗原浓度的重复性和中间精密度测定结果的RSD均≤12%，精密度良好；与肠道病毒A组71型、CV-A10、CV-A6抗原以及CV-A16疫苗工艺中的其他成分均无交叉反应，专属性良好；针对不同影响因素设计耐用性试验，回收率均在80%~120%，RSD≤7%，耐用性良好；检测CV-A16原液和制备过程中的中间产品的抗原含量均具有良好的平行性和线性，表明该方法具有良好的适用性。

结论建立了CV-A16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA，可用于CV-A16灭活疫苗（Vero细胞）中抗原的定量检测。

正文

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由肠道病毒引起的传染病，近年来在我国呈暴发流行趋势，2008年原国家卫生部将其纳入丙类传染病管理。引起HFMD的肠道病毒有20多种（型），其中柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CV-A16）是引起婴幼儿HFMD的主要病原体之一，严重威胁人类健康。CV-A16感染引起的HFMD临床主要表现为发烧、皮疹、口腔溃疡和咽炎，也可引起严重的综合感染，包括脑炎、心肌炎和急性弛缓性麻痹等重症，甚至可能导致死亡。2016年以来，随着肠道病毒A组71型（enterovirus A71，EV-A71）疫苗的使用，由EV-A71引起的HFMD病例数量虽有所下降，但由CV-A16引起的HFMD病例数量却有所增加。相关报告显示，由CV-A16引起的HFMD病例占总HFMD病例的22.04%，CV-A16引起的感染已成为重要的公共健康问题。

在CV-A16疫苗的研发过程中，CV-A16抗原的准确定量测定是疫苗质量控制和剂量确定的重要检测指标。本研究拟建立以兔抗CV-A16多克隆抗体（多抗）为包被抗体、鼠抗CV-A16单克隆抗体（单抗）为检测抗体的双抗体夹心ELISA，用于测定CV-A16抗原含量，为CV-A16灭活疫苗工艺开发和疫苗质量控制提供监测手段。

1

材料与方法

1.1

病毒、细胞及主要仪器

CV-A16毒株由北京民海生物科技有限公司（北京民海）研发中心从中国大陆HFMD流行区患儿的咽肛拭子样本中用人横纹肌肉瘤细胞分离，经噬斑纯化筛选获得，由北京民海研发中心保存于-60 ℃以下。人横纹肌肉瘤细胞也由北京民海研发中心保存。SpectraMax ABS Plus全波长多通道微孔板检测仪购自美国美谷分子公司，GHP-9080恒温培养箱购自上海一恒科技有限公司，牛血清白蛋白购自美国Sigma公司。

1.2

样品和抗原标准品

Vero细胞宿主蛋白（批号：83-2108035，蛋白浓度1 024 μg/mL）、EV-A71纯化液（批号：A71-22001-1，蛋白浓度184 μg/mL）、CV-A10抗原参考品（批号：A10-22003，蛋白浓度44 μg/mL）、CV-A6抗原参考品（批号：A6-20210701，蛋白浓度15.6 μg/mL）、脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型纯化抗原、CV-A16纯化液（批号：A16-22001、A16-22002）均由北京民海制备，其中CV-A16纯化液（批号：A16-22002）用于制备病毒空心颗粒和实心颗粒，CV-A16抗原国家标准品（批号：201507001，抗原含量：2 000 U/mL）购自中国食品药品检定研究院。

1.3

实验动物

无特定病原体级BALB/c小鼠，雌性，体重18～22 g，5只；无特定病原体级BALB/c乳鼠，1日龄，48只；清洁级日本大耳白兔，雌性，体重2.0～2.7 kg，1只；均购自中国食品药品检定研究院实验动物资源中心。实验动物伦理审批号202318；实验动物（小鼠）生产许可证号SCXK（京） 2022-0002 ，实验动物使用许可证号SYXK（京） 2021-0029；实验动物（白兔）生产许可证号SCXK（京） 2019-00170002，实验动物使用许可证号SYXK（京） 2017-0013。

1.4

兔抗CV-A16多抗的制备及鉴定

以纯化的CV-A16颗粒作为免疫原，依据免疫程序免疫日本大耳白兔，心脏取血分离血清后，用Protein A亲和层析和脱盐层析纯化获得兔抗CV-A16多抗。采用间接ELISA检测结合效价，进行SDS-PAGE分析。

1.5

鼠抗CV-A16单抗的制备及鉴定

将纯化的CV-A16抗原与等体积弗氏佐剂混合，经背部皮下多点免疫BALB/ c小鼠，50 μg/剂，选择ELISA效价较高的小鼠进行融合。获得腹水后，采用Protein A亲和层析得到鼠抗CV-A16单抗，用碘酸钠法进行酶标记。使用单抗分型检测试剂盒检测抗体亚类，采用SDS-PAGE检测纯度，微量细胞病变抑制法检测病毒中和能力。用本实验室建立的CV-A16乳鼠感染模型评价单抗的体内保护效力，即保护50%乳鼠免受病毒感染的剂量。

1.6

鼠抗CV-A16单抗对空心、实心颗粒的结合能力

分别将空心、实心颗粒稀释至0.2 μg/mL进行包被，将抗体稀释100倍，然后连续2倍稀释至12 800倍，通过检测波长450 nm、参比波长630 nm的吸光度（A450/630）值判断单抗对空心、实心颗粒的结合能力。

1.7

双抗体夹心ELISA建立

采用棋盘法确定包被抗体浓度和酶标记单抗最佳工作浓度，建立检测体系。将兔抗CV-A16多抗用碳酸盐缓冲液（pH9.6）分别稀释至1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000，包被96孔板，100 μL/孔，2~8 ℃包被过夜。用含质量分数0.5‰吐温20的PBS（PBST）洗板3次，加入封闭液（质量分数3%牛血清白蛋白），150 μL/孔，37 ℃封闭2 h，弃去封闭液，用PBST洗板3次，拍干。用样品稀释液稀释CV-A16抗原标准品至100 U/mL，样品稀释液作为阴性对照，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h；洗板3次，拍干，用抗体稀释液（0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷，质量分数0.9%NaCl、0.5‰吐温20、20%胎牛血清）稀释辣根过氧化物酶标记的鼠抗CV-A16单抗至1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000，100 μL/孔，37 ℃孵育45 min；洗板4次，拍干；每孔加入3，3'，5，5'-四甲基联苯胺显色液100 μL，室温避光显色10 min，每孔加入50 μL 1 mol/L H2SO4终止反应，经酶标仪读取A450/630值。根据检测结果确定包被抗体浓度和酶标记单抗最佳工作浓度。

1.8

方法验证

按照中国药典2020年版三部（药典三部）指导原则中的相关规定对检测方法进行验证。

1.8.1　线性范围将CV-A16抗原国家标准品从400 U/mL连续2倍稀释至8个浓度（400.000、200.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 U/mL），每个浓度均做6个复孔，按照已建立的抗原检测方法进行检测。以CV-A16抗原标准品浓度取对数作为横坐标，吸光度值取对数作为纵坐标，绘制标准曲线，考察6次结果的斜率和决定系数（R2）的一致性，以2.1×阴性均值作为阴阳性判定标准。标准曲线的R2应大于0.98。

1.8.2　准确度将CV-A16抗原国家标准品分别稀释至高、中、低3个浓度（150、50、10 U/mL），每个浓度重复2孔。独立测定6次，计算样品回收率用于评价准确度。计算公式：回收率=实测值/理论值×100%。准确度的回收率应在80%~120%。

1.8.3　精密度将CV-A16抗原国家标准品分别稀释至高、中、低3个浓度（150、50、10 U/mL），每个浓度重复2孔，由同一实验员重复测定3次，计算每个浓度检测结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），验证重复性。由3名实验员在不同日期分别重复测定3次，计算每人每次浓度检测结果的RSD，验证中间精密度。RSD计算公式：标准偏差/均值×100%。精密度的RSD不得超过15%。

1.8.4　专属性专属性样品选择CV-A6抗原参考品、EV-A71纯化液、CV-A10抗原参考品、Vero细胞宿主蛋白、脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliovirus vaccine，IPV）原液3批以及CV-A16疫苗工艺过程中的其他成分（如细胞培养液、病毒维持液、纯化用溶液等），按照已确定的抗原检测方法进行检测，以CV-A16纯化液作为阳性对照，样品稀释液作为阴性对照。以Cutoff值（2.1×阴性均值）作为阴阳性判定标准。CV-A16纯化液为阳性，其他样品均为阴性，则认为CV-A6、EV-A71、CV-A10、Vero细胞宿主蛋白、3批IPV原液及CV-A16疫苗工艺过程中的其他成分等对CV-A16抗原含量检测无干扰。

1.8.5　耐用性在其他条件不变的情况下，改变反应体系的单个条件，包括抗原孵育时间上下浮动0.5 h、酶标抗体孵育时间上下浮动15 min、显色时间上下浮动5 min、使用不同酶标仪，计算CV-A16抗原国家标准品高、中、低3个浓度（150、50、10 U/mL）的回收率和RSD。回收率应在80%~120%，不同条件耐用性不同条件结果的RSD均不得超过15%。

1.8.6　适用性用建立的方法检测3批CV-A16疫苗原液及其中间样品的抗原含量，采用双平行线法进行结果分析，统计结果的平行性及线性。

1.9

统计学分析

应用Statistical Analysis软件进行计算，分别将标准品和样品的稀释浓度取对数作x轴，A450/630值取对数作y轴，建立直线方程，根据方差分析，由F值判定，当平行性和线性差异均无统计学意义，则判定为结果可取，即采用双平行线法计算CV-A16抗原含量，以P＜0.05为差异有统计学意义。应用EXCEL 2020和GraphPad Prism8.0软件进行统计学分析。

2

结果

2.1

兔抗CV-A16多抗的制备及鉴定

兔抗CV-A16多抗蛋白含量为3.089 mg/mL，结合效价为1∶1 024 000，中和抗体效价为1∶6 144，经SDS-PAGE分析，纯度为98.1%，在表观相对分子量约24 000和50 000处有明显的轻、重链，见图1。

2.2

鼠抗CV-A16单抗的制备及鉴定

经过多轮筛选，从获得的14株单抗中选出具有高亲和力、高中和活性的1株鼠抗CV-A16单抗（编号24G9）。其结合效价为1∶128 000，中和抗体效价为1∶3 072，经鉴定单抗的亚型为IgG3。纯化后的鼠抗CV-A16单抗经SDS-PAGE分析，在表观相对分子量约24 000和50 000处有明显的轻链和重链，见图2。且1 μg单抗可以保护50%乳鼠免受病毒感染，具有良好的保护效果，见图3。

2.3

14株单抗对空心、实心颗粒的结合能力

由图4可知，14株单抗中24G9单抗对空、实心颗粒抗原结合能力最为接近。

2.4

双抗体夹心ELISA的建立

通过对ELISA条件的优化，建立了检测CV-A16抗原含量的双抗体夹心ELISA法，经检测，包被抗体浓度和酶标记单抗稀释比例确定为1∶20 000和1∶10 000。

2.5

方法验证

2.5.1　线性范围6次实验结果显示当抗原含量在3.125~400.000 U/mL范围内时，斜率在0.684 3~0.723 2之间，R2在0.983 9~0.991 3之间，表明该方法线性良好，见图5。

2.5.2　准确度用建立的方法检测高、中、低3种浓度（150、50、10 U/mL）的CV-A16抗原国家标准品，回收率均在80%~120%之间，RSD均≤11%，见表1。

2.5.3　精密度

2.5.3.1　重复性由同一实验员对高、中、低3种浓度（150、50、10 U/mL）的CV-A16抗原国家标准品用建立的方法重复测定3次，结果显示，RSD分别为6%、11%和12%，见表2。

2.5.3.2　中间精密度由3名实验员在不同日期对高、中、低3种浓度（150、50、10 U/mL）的CV-A16抗原国家标准品用建立的方法进行3次测定，结果显示RSD分别为5%、9%和10%，见表3。

2.5.4　专属性用建立的ELISA方法分别检测CV-A6抗原参考品、EV-A71纯化液、CV-A10抗原参考品、Vero细胞宿主蛋白、3批IPV原液以及CV-A16疫苗工艺过程中的其他成分（如细胞培养液、病毒维持液、纯化用溶液等），结果显示CV-A16纯化液结果为阳性，其他检测样品均为阴性，对CV-A16抗原含量检测均无干扰，见图6。

2.5.5　耐用性在其他条件不变的情况下，改变反应体系的单个条件，包括抗原孵育时间上下浮动0.5 h、酶标抗体孵育时间上下浮动15 min、显色时间上下浮动5 min、使用不同酶标仪，再用建立的ELISA方法检测高、中、低3种浓度（150、50、10 U/mL）的CV-A16抗原国家标准品。结果显示，回收率均在80%~120%之间，RSD≤7%，见表4。

2.5.6　适用性采用已建立的抗原检测方法对3批次疫苗原液制备过程中的中间产物，如病毒收获液、纯化收获液1、纯化收获液2、纯化收获液3、纯化收获液4、原液进行CV-A16抗原含量测定，检测结果的线性和平行性差异均无统计学意义，见表5—6。

3

EV-A71疫苗上市以来，虽已有效降低HFMD重症和死亡的发生率，但其缺乏交叉保护力，不能抵抗其他病原体引起的HMFD，且CV-A16疫苗的研发进展较缓慢，目前仍无相关疫苗上市，CV-A16感染机制的研究及CV-A16单价、多价疫苗的研发仍迫在眉睫。

疫苗研发过程中体外效力的检测直接关乎疫苗免疫原性的效果评估，抗原含量测定是HFMD疫苗生产工艺和成品质量控制中最重要的质控指标。有学者利用病毒蛋白1基因全序列将CV-A16分为 A、B、C 基因型，又将其中C基因型分为 C1、C2、C3 亚型，并认为在1995年，CV-A16由B型向C型转变，在2002年，CV-A16由C1亚型向C2亚型转变，并在2005年转变为C3亚型。由于低保真复制和频繁的重组，CV-A16具有突变率高的特点。基于以上CV-A16分子流行病学的特点，需要建立可以克服CV-A16高突变率且广谱性强、特异性好的检测方法。

为加快CV-A16疫苗和HFMD多价疫苗的研发进展，本研究采用了亲和力高、中和活性好、特异性强的抗CV-A16单抗和多抗，对建立CV-A16抗原定量检测方法具有十分重要的意义。单抗广泛应用于 ELISA 体系，筛选出1株特异性强、中和能力高且与保护性相关的单抗对CV-A16抗原检测试剂盒至关重要。本研究选取的单抗不仅具有较强的结合与中和能力，并能够特异性结合病毒蛋白1，以及保护1日龄乳鼠免于CV-A16的致死性攻击，而且对空心、实心颗粒的抗原结合能力较为均一。本研究建立了CV-A16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA，并根据药典三部的要求，对检测方法进行了验证。建立的双抗体夹心ELISA的线性、专属性、准确度、精密度、耐用性等均符合可接受标准，并初步进行了适用性研究。该方法可以准确地测定疫苗原液制备过程中不同阶段样品的抗原含量，且供试品与标准品的线性和平行性差异均无统计学意义，满足疫苗原液制备过程中对不同阶段样品的抗原含量进行准确定量的需求，表明该方法适用性良好，为疫苗研发过程中规格、剂量、剂型等的研究奠定了基础。由于本研究并未对需要解吸附的铝佐剂成品进行检测研究，解吸附后的成品抗原结构是否发生变化以及与CV-A16抗原识别表位是否有一定的关系尚未可知，因此需对此做进一步分析。

综上所述，本实验建立的双抗体夹心 ELISA抗原检测方法具有较高的广谱性、灵敏度、特异性和稳定性，可初步应用于CV-A16疫苗质量控制和工艺开发的研究。

作者

赵丽丽 张改梅 陈磊 谢学超 王笑天 黄仕 李国顺 顾美荣

北京民海生物科技有限公司研发中心，北京市新型联合疫苗工程技术研究中心，北京 102600

通信作者：顾美荣，

Email：6088gmr@sina.com

引用本文：赵丽丽, 张改梅, 陈磊, 等.柯萨奇病毒A组16型灭活疫苗（Vero细胞）抗原定量检测方法的建立及应用[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(4): 259-265.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241022-00067

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