《食品科学》：武汉轻工大学杨庆博士等：自由基介导迷迭香酸与蛋清蛋白的偶联对抗原性和功能特性的影响

蛋清蛋白（EWP）是一种高营养的动物蛋白，由大约40种不同的蛋白质组成。EWP的主要成分包括卵清蛋白、卵黏液样蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶，是其营养特性的重要组成部分，促进人体健康生长。EWP具有独特的营养价值和功能特性，然而，将其掺入食品中会对其成分敏感的个体造成过敏反应风险，可能导致严重的过敏症状。

食品蛋白质的抗原性受结构和构象变化的影响，可通过多种加工方法进行调节，包括物理方法（如高压处理、热处理）、化学方法（如美拉德反应、酰化）和酶加工。其中，用多酚修饰蛋白质已成为减轻过敏原和改善食品蛋白质功能特性的重要策略，这主要是由于多酚固有的抗氧化能力。

迷迭香酸（RA）是一种天然多酚化合物，它具有多种与人体健康相关的有益生物活性，包括抑制炎症、抗氧化和神经保护等功能。之前的研究表明，RA可以通过碱法和自由基法与卵清蛋白共价偶联，导致卵清蛋白的免疫球蛋白（Ig）E结合能力降低。同样，经碱性处理的RA与EWP的共价偶联已被证明可以降低其IgE结合能力，同时增强EWP的功能特性。

武汉轻工大学食品科学与工程学院的刘颖、陈仕云、杨庆*等研究采用自由基介导EWP-RA偶联的方法，研究了RA对EWP结构和功能性质的影响。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和多酚结合量分析验证RA与EWP之间的共价结合。采用扫描电镜和粒度分析表征EWP-RA偶联物的微观结构变化，并采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、圆二色光谱（CD）、荧光光谱和紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）等研究其结构变化。此外，评估EWP-RA复合物的表面疏水性、柔韧性、抗氧化活性、抗原性和乳化性能，利用多酚共价修饰蛋白质可以显著改进蛋白质性质的特点，以期为开发EWP的应用提供新思路。

1 EWP-RA偶联物的制备分析

与未修饰的EWP相比，EWP-RA偶联物SDS-PAGE图谱的蛋白条带向上迁移（图1A），这可能是由于RA与EWP的共价偶联，导致蛋白质交联。这一发现与之前观察到的由儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和槲皮素等多酚修饰的食物蛋白质的条带迁移模式一致。多酚结合量是评价不同制备条件下多酚与蛋白质结合程度的定量指标。RA添加量从0%增加到0.2%，多酚结合量显著增加（

P

＜0.05）。具体来说，RA添加量为0.2%时，多酚结合量达到最大值（（149.06±1.19）mg/g）（图1B）。SDS-PAGE图谱上EWP-RA偶联物条带的迁移和多酚结合量的增加，均表明RA成功偶联到EWP蛋白上。

游离—SH是表征蛋白质构象和功能特性的关键指标。如图1C所示，随着RA添加量的增加，EWP中游离—SH含量显著增加（

P

＜0.05），从（4.29±0.78）μmol/mg（EWP-RA 0）增加到（44.62±0.90）μmol/mg（EWP-RA 0.2）。

游离—SH含量的增加可归因于二硫键的断裂，导致蛋白质结构内的游离—SH暴露。因此，—SH含量的变化表明EWP的展开和结构修饰，RA添加量越多，EWP的结构更为展开。

羰基的形成是蛋白质氧化的一个特征。如图1D所示，EWP游离羰基含量从（1.32±0.04）nmol/mg（EWPRA 0）显著降低至（0.14±0.09）nmol/mg（EWP-RA 0.2）（

P

＜0.05）。羰基含量的减少表明RA对蛋白质氧化有潜在的抑制作用，这可能归因于RA的抗氧化活性，RA的添加可抑制蛋白的氧化，这有利于其应用到食品工业中，例如延长货架期等。

2 粒径、ζ电位及SEM分析

随着RA添加量的增加，EWP-RA偶联物的粒径显著增大（

P

＜0.05）。在RA添加量为0.2%时，EWP-RA偶联物的最大粒径为（5 395.7±172.6）nm（图2A）。这一趋势与EGCG共轭乳清蛋白分离物的结果一致，其中复合物的粒径也随着EGCG浓度的升高而逐渐增加。这种现象可归因于蛋白质-多酚偶联物中多酚的氧化和交联，这可能有助于增加颗粒尺寸和形成稳定的网络结构，使蛋白变得更稳定，有利于应用到食品工业中。此外，EWP-RA偶联物的多分散指数随RA添加量的变化而出现波动（图2A）。这种变化可以用EWP与RA共轭引起的粒子分布相对变化进行解释。

ζ电位表示溶液中粒子表面的电荷强度，并作为静电排斥或吸引存在的量度。如图2B所示，RA的加入导致ζ电位从（24.5±0.69）mV（EWP-RA 0）下降到（19.07±0.23）mV（EWP-RA 0.05），随后增加到（23.77±0.40）mV（EWP-RA 0.2）。在较低的RA水平下，RA可能与蛋白质表面的正电荷结合，导致这些表面电荷被中和，ζ电位相应降低。随着RA添加量的增加，促进与EWP形成新的稳定的带正电配合物，从而改变整体的电荷状态。当RA添加量升高时，粒子间的静电斥力可能会增强，从而导致Zeta电位的增加。

如图2C所示，与EWP相比，EWP-RA样品显示出更多的裂纹和碎片，说明由于RA的共轭作用，EWP的大层状结构被破坏。此外，随着RA偶联比例的增加，蛋白质偶联物内的片段和裂缝的程度增加。表明EWP与多酚之间的相互作用导致分子间力的破坏，导致蛋白质结构更加无序。

3 EWP的结构变化

蛋白质的物理化学性质和功能从根本上受其空间结构的影响。EWP的FTIR显示出明显的吸收带，分别对应于酰胺A带和酰胺I带在3 300～3 500 cm-1和1 600～1 700 cm-1附近的振动（图3A）。EWA-RA偶联物与EWP之间光谱峰强度和位置的显著差异表明其结构发生了显著变化。酰胺A带对应于与氢键耦合的N—H拉伸，酰胺I带对应于肽键的C＝O拉伸振动。与RA共价结合后，酰胺A带吸收带发生移位，表明—NH2基团参与了EWP与RA之间的共价结合。此外，在EWP-RA偶联物中观察到的酰胺I带相对于EWP蓝移，表明肽键C＝O拉伸振动特性发生了改变。这一转变表明电子环境的变化和偶联物内肽键周围氢键相互作用的变化，可能反映了与RA共轭引起的二级结构或构象动力学的变化。结构改变可能影响EWP抗原构象表位的暴露情况，从而降低其免疫原性。

在典型的CD光谱中，在192 nm波长附近观察到

-螺旋对应的正信号，而在216～218 nm波长处出现指示

-折叠的负信号。如图3B所示，RA偶联导致信号强度明显改变，表明蛋白质的二级结构发生了变化。CD数据分析表明，EWP-RA 0的二级结构由24.98%的

-螺旋、41.86%的

-折叠、22.29%的β-转角和10.87%的无规卷曲组成。然而，在EWP-RA偶联物中，观察到

-螺旋含量显著降低，同时

-折叠含量大幅增加。具体而言，EWP-RA 0.2的二级结构包含4.58%

-螺旋、44.76%

-折叠、23.74%

-转角和26.92%无规卷曲（表1）。这些变化表明RA添加量过高可能破坏EWP内部的氢键网络，导致肽链拉伸和氢键作用的增强。此外，突出的

-折叠二级结构的存在通常与蛋白质更灵活和开放的构象状态有关。这种二级结构的转变可能影响EWP蛋白抗原构象表位和线性表位的暴露，降低与IgG和IgE结合的能力，从而降低其免疫原性。

蛋白质的三级结构通常通过紫外线吸收的变化进行评估。发色团主要位于芳香氨基酸中，如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，随着蛋白质结构的改变而发生变化。如图3C所示，与单独的EWP相比，RA的偶联导致EWP的紫外吸收强度增加，表明蛋白质展开和结构重排。随着RA浓度的增加，EWP-RA偶联物的吸收峰出现轻微的红移。这一现象表明EWP构象发生改变，导致芳香氨基酸残基暴露于外界环境中。此外，所有EWP-RA偶联物在340 nm波长附近都出现了新的吸收峰，这可能是由于RA的特征性紫外吸收峰的吸收特性。

内源性荧光的分析为蛋白质微环境和三级结构的变化提供了可靠的评估。如图3D所示，RA添加量的增加与EWP-RA偶联物的荧光强度显著降低相关。这表明在RA偶联后EWP结构完整性被破坏。因此，观察到EWPRA偶联物的荧光最大峰波长出现了明显的蓝移，这主要是由于芳香氨基酸和多酚之间形成了非发光基态配合物，导致EWP荧光猝灭。紫外和荧光结果都表明EWP的表面性质发生了改变，改变了抗原构象表位的暴露情况，进一步降低了其免疫原性。

4 体外抗氧化能力分析

清除自由基的能力是评估酚类化合物作为功能性食品添加剂时，其货架稳定性和潜在健康益处的关键指标。如图4A、B所示，EWP-RA偶联物的自由基清除率随着RA添加量的升高而显著增加（

P

＜0.05）。其中，EWPRA 0.2对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除率分别达到58.59%和72.08%。RA被认为是一种有效的自由基淬灭剂，与EWP结合的RA浓度越高，抗氧化能力越强。RA的偶联提升了EWP的抗氧化能力，这有利于其在食品工业中的应用。

5 免疫原性分析

EWP-RA偶联物的抗原性可通过对IgG和IgE的结合亲和力进行评估，如图5所示，随着RA添加量的增加抗原性下降。其中，EWP-RA 0.2偶联物对IgG和IgE的竞争性结合抑制率分别降至29.94%和24.85%。值得注意的是，过敏原对IgG和IgE的结合能力受到食物过敏原中存在的线性和构象表位的影响。降低食物过敏原免疫原性的主要策略包括对这些蛋白质进行化学修饰以破坏其结构完整性。在本研究中，自由基介导的RA与EWP的共价偶联显著降低了EWP的抗原结合潜力，观察到抗原性降低归因于RA修饰引起的结构破坏。上述结构变化中的结果也印证了这一点，RA影响了蛋白线性和构象表位的暴露，从而降低其免疫原性。

6 柔韧性和表面疏水性分析

柔韧性是蛋白质的一个关键结构特性，它与蛋白质的功能特性，特别是界面行为有着内在的联系。如图6A所示，EWP-RA偶联物的柔韧性较EWP显著增强，其中EWP-RA 0.05的

A

0 最高，为8.33±0.30。然而，当RA添加量增加到0.1%和0.2%时，相对于EWP-RA 0.05的蛋白质柔韧性下降。这一现象与碱性方法诱导的RA与EWP结合的结果一致。总地来说，在低水平下，RA修饰促进了EWP展开的构象。RA添加量的进一步增加可能促进蛋白质分子的交联或聚集，从而形成稳定的结构。这种交联效应限制了蛋白质的流动性，从而影响了其灵活性，上述结构分析也证实了这些变化，这种变化使其结构更稳定，有利于应用到食品工业中。

蛋白质的疏水性反映了其表面疏水性基团的存在，是评估蛋白质乳化性能的关键参数。在EWP-RA偶联物中，RA比例的增加与表面疏水性的增强相关，其中EWP-RA 0.2的

H

0 最高，为284.59±46.15（图6B）。这归因于诱导蛋白质结构展开的偶联相互作用，从而将先前埋藏的疏水性基团暴露在蛋白质表面，蛋白质能够更好地定位在油-水界面，进而促进乳化液的形成，提高乳化活性。在米糠蛋白中也有类似的结果，其中儿茶素的掺入导致疏水性增加，

H

0增加。

7 乳化性能分析

乳化能力可由EAI和ESI进行定义，EAI能够量化吸附速率，而ESI能够评估对聚结的抗性。如图7A、B所示，与单独的EWP相比，EWP-RA偶联物的EAI和ESI整体增强。EWP-RA 0.02的EAI为1.21 m2/g，EWP-RA 0.05的EAI达到1.35 m2/g，表明EWP对油滴表面的吸附能力有所提高。这种增强可能是由于修饰蛋白中暴露了额外的疏水性基团，从而增加了其对油-水界面的亲和力，增强了乳化活性。EWP-RA 0.02的ESI为64.20 min，与EWP相比显著延长。然而，其他EWP-RA偶联物的ESI值与EWP相比没有显著差异。考虑到偶联化合物的结构稳定性和抗氧化性能的提高，可以推断，RA修饰的EWP有效增强了蛋白质的乳化性和稳定性，结合结构的改变，RA的修饰有效地降低了EWP的免疫原性，有利于应用到食品工业中。

结论

本研究采用自由基法合成EWP-RA偶联物，通过FTIR、UV、荧光光谱和CD光谱进行分析，证实了EWP与RA偶联后的结构被修饰。ELISA结果显示，EWP的抗原性降低，表明RA偶联明显破坏了EWP的表位。此外，经偶联处理后，EWP的乳化性能得到了提高。本研究可为进一步研究自由基介导的蛋白质-多酚在食品成分中的相互作用建立基础框架。

本文《自由基介导迷迭香酸与蛋清蛋白的偶联对抗原性和功能特性的影响》来源于《食品科学》2025年46卷第12期75-83页，作者：刘颖，陈仕云，郭小，郝亚成，方敏，柳鑫，宫智勇，杨 庆*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241127-189。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：刘芯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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