《食品科学》：河南工业大学张浩博士等：基于超临界流体色谱-串联质谱法同时测定乳液中α,β-不饱和醛

乳液作为最常见的含油食品体系之一，承担着必需脂肪酸、维生素和活性营养成分载体的作用。例如，利用乳液体系包埋亚麻籽油可有效解决亚麻籽油在水相食品体系中混溶性差和生物利用率低的缺陷，扩大亚麻籽油在多元食品体系中的应用范围。然而，乳液是一个具有水-油界面的多相态热不稳定体系，极易造成亚麻籽油等富含多不饱和脂肪酸的植物油在储存过程中发生氧化，导致其营养价值和食用安全性降低。在此过程中，甘油三酯会发生水解、自由基形成、过氧化、环化、聚合、异裂等一系列反应，生成游离脂肪酸、甘油一酯和甘油二酯、初级脂质氧化产物（LOPs）和各种次级LOPs。在各类LOPs中，α,β-不饱和醛因其具有与蛋白质、DNA、磷脂（脑磷脂和丝氨酸磷脂）等生物大分子的高反应活性，越来越多的细胞和动物毒性研究将其定义为导致油脂氧化后食用安全性降低的主要因素。

α,β-不饱和醛的反应活性和毒性与其结构和浓度密切相关。除了生物毒性，个别α,β-不饱和醛还具有感官特性。因此，对α,β-不饱和醛的定性和定量分析是评估乳液油脂氧化状态和毒理性特征的必要前提。超临界流体色谱（SFC）的样品脱溶剂和离子化效率比液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）更好，这大大提高了配备常规电喷雾离子源（ESI）检测器对α,β-不饱和醛衍生化产物进行痕量分析的可行性。

河南工业大学粮油食品学院的王曙、魏世肖、张浩*等拟通过2,4-二硝基苯肼（DNPH）柱前衍生化和溶剂萃取对乳液进行前处理，采用SFC-MS/MS建立同时分析乳液中不同结构

1 质谱和SFC条件优化

为确定各目标物在本实验所采用的三重四极杆质谱仪中电离出的母离子质荷比，以及在多重反应监测（MRM）模式下的最佳定量子粒子和碰撞电压，将中等浓度α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物混标连续泵入三重四极杆质谱仪，在负离子模式下分别进行一级和二级质谱扫描。如图1所示，定量子粒子质荷比的选择和碰撞电压的大小对目标物MRM提取离子流图信号具有显著影响。在MRM模式下确定各个α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物的最佳定量子离子和碰撞电压，优化后的α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物MRM模式下质谱参数见表2。

由于本实验同时分析的α,β-不饱和醛种类多，且碳链长度覆盖范围大（3～10 个碳），使得经DNPH衍生化后的产物极性相差大。因此，本实验选择与样品溶液一致的乙腈作为有机相改性剂，考察改性剂初始比例和梯度洗脱程序（表1）对8 种α,β-不饱和醛衍生化产物的色谱峰形以及信噪比的影响。

通过对比4 种洗脱条件下色谱图可以发现，初始的乙腈洗脱比例和色谱程序对α,β-不饱和醛衍生化产物的出峰顺序和色谱信号有显著影响（图2）。当初始乙腈比例为10%（洗脱程序1）时，己烯醛和2,4-癸二烯醛的DNPH衍生化产物色谱峰出现了明显的分叉，影响两种分析物的定量精确度。将初始乙腈比例提高到20%（洗脱程序2）后，明显改善了色谱峰的分叉现象，但由于色谱峰洗脱时间显著迁移，导致4-羟基-2-壬烯醛-DNPH衍生化产物的信号值显著降低。这可能是由于高比例乙腈的洗脱强度过大，导致部分α,β-不饱和醛衍生化产物与DNPH衍生化试剂等样品中干扰物共洗出，产生了强烈的基质效应干扰。为改善色谱峰形同时提高分析物信噪比，本实验尝试将初始乙腈比例调整到5%，并通过梯度洗脱程序调整各α,β-不饱和醛衍生化产物的保留时间。在洗脱程序4下，各分析物峰形良好，同时4-羟基-2-壬烯醛-DNPH和丙二醛-DNPH衍生化产物的信噪比分别是洗脱程序2和3的11.7、10.1 倍。

确定质谱和SFC条件后，为验证本仪器检测方法与传统LC-MS方法之间的差异，将本实验中所采用的超临界流体色谱仪切换为液相色谱模式，对8 种α,β-不饱和醛衍生化产物进行分析。由于共用一台质谱检测器，因此质谱检测器参数不变。如图3所示，本实验建立的SFC-MS/MS方法能够在4 min内完成对8 种α,β-不饱和醛衍生化产物的同时分析，而LC-MS/MS下的分析时间则超过20 min。此外，在同一混标浓度条件下，α,β-不饱和醛衍生化产物在SFC-MS/MS方法下的信号强度远大于LC-MS/MS方法。

为进一步量化8 种α,β-不饱和醛衍生化产物在SFCMS/MS和LC-MS/MS方法下的差异，对所有目标物进行积分，峰面积结果如图4所示。在本实验所建立的SFCMS/MS方法下，8 种α,β-不饱和醛衍生化产物的峰面积为LC-MS/MS方法的5.54～23.16 倍，LC-MS/MS方法甚至无法检出丙二醛-DNPH衍生化产物。本实验中8 种衍生化产物在SFC-MS/MS方法下呈现良好的信噪比可能是由于在进入质谱检测器前，高比例CO2流体的挥发大大提高了分析物在离子源中的浓度和离子化效率，从而增强了其在质谱检测器中的响应信号。此外，α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物属于中低极性化合物，其在ESI中的电离容易受到水分子的影响，导致其离子化效率远低于在APCI中。而对于SFC-MS/MS方法，其流动相中不存在水分子，因而可以避免水分子对分析物电离的抑制作用。

2 样品前处理优化

水包油乳液是在乳化剂的作用下，油相均匀稳定地分散在水相中形成的一个结构复杂的多相态体系，且乳液中成分复杂，乳液中含有的脂溶性物质、表面活性剂及氧化降解产物都会对α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物的检测产生影响。因此本研究采用溶剂提取法对乳液中的α,β-不饱和醛进行提取。

首先用乙腈将乳液样品中的α,β-不饱和醛提取出来，由于各种α,β-不饱和醛的极性存在差异，乙腈对每种物质的提取效率不同，为了使样品中的α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物提取完全，以及保证实验效率和降低溶剂消耗，对乙腈溶剂提取次数进行优化，对样品进行5 次提取，单次提取单独进样。如图5所示，发现4 次提取条件下，各种物质提取率均达到99.9%，因此确定乙腈溶剂提取次数为4。

此外，在实验过程中发现乳液中乳化剂的存在会显著影响α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物在质谱中的信号强度，由图6可知，在乳化剂吐温-20的存在下，各种α,β-不饱和醛的峰面积均降低，是不含吐温-20样品峰面积的77.5%～94.5%。因此，本研究利用吐温-20在二氯甲烷中溶解性差的特点，对乙腈提取液进行二次提取和浓缩，通过对二氯甲烷提取次数进行优化，发现利用二氯甲烷对乙腈提取液进行3 次提取时，各物质提取率即可达到99.9%（图5）。

相较于传统液相色谱流动相，超临界CO2对分析物的洗脱能力更强，会导致衍生化试剂DNPH和极性最强的丙二醛-DNPH衍生化产物极易在SFC模式下共洗出，从而使得样品中过量的DNPH对目标分析物产生严重的基质效应，降低其信号强度。另一方面，DNPH添加量过低又可能导致样品中α,β-不饱和醛衍生化不完全，低估其含量。因此，本实验探究了DNPH添加量和衍生化时间对不同α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物峰面积的影响，结果如图7A所示。

DNPH添加量在1.25 mg范围内，各衍生化产物的峰面积随着添加量的增加而增加，继续增加DNPH添加量会导致2,4-癸二烯醛和4-羟基-2-己烯醛衍生化产物的峰面积出现明显下降。这可能是过量的DNPH对两种α,β-不饱和醛衍生化产物在质谱中产生强烈的基质效应造成。由图7B可知，8 种α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物的峰面积在均在30 min达到最大值，随着衍生化时间的延长，部分目标物如2,4-癸二烯醛、4-羟基-2-己烯醛和4-羟基-2-壬烯醛的衍生化产物峰面积出现明显下降，可能是由于3 种α,β-不饱和醛碳链过长，导致衍生化产物结构中烯键位置容易发生氧化或加成反应。因此，本研究确定的DNPH最佳添加量为1.25 mg，最佳衍生化时间为30 min。

3 检测方法的方法学考察

采用不易氧化的椰子油水包油乳液为基质，加入一定浓度α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物标准液并逐级稀释，分别以其对应的色谱峰信噪比3和10时物质浓度作为该目标物的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。同时以各物质LOQ为起点，测定并绘制8 种α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物的标准工作曲线，确定其线性范围，结果如表3所示。所有目标分析物在其样品浓度范围内线性良好，决定系数R2均在0.999 5以上，LOQ均低于1.8 μg/kg。日内和日间梯度标准溶液的重复测定相对标准偏差（RSD）及测定准确度均低于7.86%，表明仪器稳定性和准确性良好。选用椰子油乳液为基质，分别以线性范围下限值的200%、中间值和上限值的80%为添加量进行加标回收率测定，8 种α,β-不饱和醛-DNPH衍生化产物的回收率范围为85.8%～106.7%，证明建立的SFC-MS/MS方法满足对乳液中8 种α,β-不饱和醛定量分析的准确性。

4 亚麻籽油水包油乳液贮藏过程中α,β-不饱和醛含量的变化规律

为验证方法的适用性，以亚麻籽油水包油乳液为对象，监测其在40 ℃贮藏条件下8 种α,β-不饱和醛的含量变化规律，结果如图8所示。在乳液贮藏过程中，对于监测的8 种α,β-不饱和醛，未添加多酚型抗氧化剂的乳液中除2,4-癸二烯醛外，其余7 种α,β-不饱和醛含量均随贮藏时间的延长而显著增加，其中丙二醛含量最高，10 d后含量可达65.96 mg/kg，其次为4-羟基-己烯醛和4-羟基-壬烯醛，含量分别为47.89 mg/kg和15.42 mg/kg。当在乳液中加入多酚型抗氧化剂后，3 种多酚均对乳液贮藏过程中α,β-不饱和醛的积累产生了明显的抑制作用。含有多酚型抗氧化剂的乳液在贮藏1 d内，8 种α,β-不饱和醛的含量均未明显增加，尤其对于丙烯醛、戊烯醛、己烯醛、庚烯醛、4-羟基-己烯醛和4-羟基-壬烯醛，六者的含量在贮藏3 d后才出现明显的增加，表明多酚型抗氧化剂对这6 种醛的减控作用最强。贮藏10 d后，没食子酸丙酯组中，除2,4-癸二烯醛外的其余7 种α,β-不饱和醛的含量明显低于空白组71.29%～93.60%，表明3 种多酚型抗氧化剂中没食子酸丙酯对α,β-不饱和醛积累的抑制作用显著强于没食子酸和槲皮素。

在8 种α,β-不饱和醛中，2,4-癸二烯醛的含量在所有乳液样品中均随贮藏时间的延长呈现波动趋势，这与余茜报道的亚麻籽油纯油体系中2,4-癸二烯醛含量随贮藏时间延长呈现快速增长的规律不同。此外，丙二醛和4-羟基-己烯醛是亚麻籽油水包油乳液中典型的α,β-不饱和醛，这与马路凯的报道一致，即4-羟基-己烯醛是ω-3型脂肪酸特征的油脂氧化α,β-不饱和醛。但是本研究发现乳液贮藏过程中生成量前3的α,β-不饱和醛分别是丙二醛、4-羟基-己烯醛和4-羟基-壬烯醛，这也与余茜报道的亚麻籽油纯油体系贮藏过程中α,β-不饱和醛变化规律不同，即纯油体系中含量前3的α,β-不饱和醛是丙二醛、戊烯醛和己烯醛。上述结果表明乳液和纯油体系中油脂氧化产生的次级氧化产物α,β-不饱和醛的生成规律显著不同。这可能是由于真实乳液体系和纯油体系中油脂的氧化机制不同，乳液油脂的氧化不仅发生在油脂内部，由于乳液具有的多相态属性以及高比表面积促进了油脂中不饱和双键与促氧化因子接触，使得油脂氧化产生的初级氧化产物裂解成为小分子醛类物质的种类不同。

为进一步探究多酚型抗氧化剂对乳液贮藏过程中α,β-不饱和醛积累的减控机制，对乳液贮藏过程中的过氧化物值和共轭二烯值两种表征油脂氧化初级产物的指标进行测定，结果如图9A、B所示。在未添加多酚的乳液中，过氧化值和共轭二烯值均呈现先迅速增加后降低的趋势，可能是由于在密闭条件下氧气消耗完的同时贮藏初期积累的初级氧化产物逐渐裂解为次级氧化产物。另一方面，添加有多酚型抗氧化剂的乳液中过氧化值显著低于空白组，共轭二烯值在下降阶段的下降速度也显著快于空白组，且3 种多酚型抗氧化剂的抗氧化作用大小依次为没食子酸＞没食子酸丙酯＝槲皮素，这与3 种多酚型抗氧化剂对乳液中α,β-不饱和醛的减控作用强弱不同（图8），说明除了抗氧化作用，3 种多酚型抗氧化剂还通过其他途径抑制α,β-不饱和醛的积累。卢永翎等、Chen Min等、张浩研究发现多酚能够通过迈克尔加成反应实现对丙烯醛等α,β-不饱和醛的清除。通过对贮藏过程中多酚型抗氧化剂保留率进行监测，发现随着贮藏的进行，3 种多酚型抗氧化剂的多酚保留率均急剧下降（图9C）。值得注意的是，对α,β-不饱和醛减控作用最强的没食子酸丙酯消耗最快，贮藏3 d后保留率仅为16.37%，这与α,β-不饱和醛含量在贮藏3 d后迅速增加的结果相印证。因此可以推测多酚型抗氧化剂不仅通过抗氧化作用，还通过羰基清除作用实现对乳液贮藏过程中α,β-不饱和醛积累的抑制。

5 结论

丙烯醛、戊烯醛、己烯醛、庚烯醛、4-羟基-2-己烯醛、4-羟基-2-壬烯醛和2,4-癸二烯醛的检测方法，此分析方法中8 种本实验使用SFC-MS/MS建立了同时快速检测乳液中丙二醛、α,β-不饱和醛在各自样品浓度范围内均呈现良好的线性关系，LOQ均低于1.8 μg/kg，加标回收率为85.8%～106.7%，测定准确度和RSD均低于7.86%。该方法前处理简单、方法学结果良好，且分析时间远短于常规LC-MS/MS，填补了乳液中主要α,β-不饱和醛同时检测方法的空白。通过监测亚麻籽油乳液贮藏过程中α,β-不饱和醛含量的变化，结合共轭二烯值和过氧化值的分析发现，乳液贮藏过程中α,β-不饱和醛快速积累，含量最高的3 种分别为丙二醛、4-羟基-2-己烯醛和4-羟基-2-壬烯醛。此外，多酚型抗氧化剂的添加可以抑制油脂氧化和清除乳液贮藏过程中α,β-不饱和醛的积累。后续可以利用本研究建立的方法，结合实际生产，对富含多不饱和脂肪酸的功能性乳液生产和贮运过程中α,β-不饱和醛的生成和分布进行探索，为降低我国居民膳食摄入α,β-不饱和醛的风险和防御乳液油脂氧化危害提供技术和理论支撑。

本文《基于超临界流体色谱-串联质谱法同时测定乳液中

实习编辑：栾文莉；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为进一步促进动物源食品科学理论的完善与创新，加速科研成果向实际生产力的转化，助力产业实现高质量、可持续发展，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、中国食品杂志社将与江西农业大学、江西科技师范大学、 南昌师范学院、 家禽遗传改良江西省重点实验室 共同举办的“ 2025年动物源食品科学与人类健康国际研讨会 ”，将于 2025年10月25-26日 在 中国 江西 南昌 召开。

长按或微信扫码进行注册

北京食品科学研究院、中国食品杂志社和全国糖酒会组委会将于2025年10月16-18日在江苏省南京市南京国际博览中心举办第113 届全国糖酒会食品科技成果交流会。食品科技成果交流会期间举办食品科技成果展，本届科技成果展以我国当前食品产业科技需求为导向，重点邀请“十四五”以来获得国家和省部级重要科研项目支持产出的食品科技新成果、新技术、新产品参展，并针对企业技术需要开展精准对接服务。

长按或微信扫码进行注册

以上会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）