疫苗前沿 | 增强mRNA癌症疫苗免疫效应的策略：mRNA区室化设计

导读：mRNA疫苗为癌症免疫疗法带来了很大的希望，但是由于mRNA表达效率低和免疫刺激不足，限制了其疗效。2024年11月22日，中国科学院国家纳米科学中心陈春英院士团队Science AdvancesIF=11.7上发表题目为mRNA Compartmentalization via Multimodule DNA Nanostructure Assembly Augments the Immunogenicity and Efficacy of Cancer mRNA Vaccine的研究型文章文中宣布，他们开发了一种基于mRNA区室化的癌症疫苗，该疫苗采用多模块DNA纳米结构(MMDNS)组装的区室，其中包含编码抗原的mRNA、CpG寡核苷酸(ODNs)、酸性环境响应性富含C序列和靶向树突状细胞的适配体。MMDNS通过原位局部浓缩mRNA及相关反应分子，实现高效的mRNA翻译，并显著增强免疫反应，有效抑制肿瘤生长和转移，为癌症免疫治疗提供了一种强有力的策略。今天，由菌菌带大家详细解读这篇文献。

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绪论：癌症mRNA疫苗与区室化

为了增强mRNA疫苗的效果，研究者们进行了大量的递送系统研究，来增加细胞摄取并促进内溶酶体逃逸，但目前仍然只有1-2%的RNA从内体释放完成递送。因此，提高有限细胞mRNA拷贝的翻译效率对蛋白质的表达与靶向递送都至关重要。

现代生物学认为，由自发自组装过程驱动的无膜区室在细胞功能中起着关键作用。这些区室通过空间定位和反应物的局部浓缩，能够显著影响细胞内的生化反应。在之前的研究中证实，基因区室化可以通过邻近效应和限制效应显著促进基因表达。因此，作者通过将mRNA及相关反应分子局部浓缩在特定的区室中，以此提高mRNA的翻译效率，从而为基于mRNA的癌症免疫治疗提供更高效的策略。

02

MMDNS的分子设计与构建

细胞内酸性环境诱导MMDNS在溶酶体中组装的机制，如图1B所示。基于此，作者进行了一系列的分子设计，首先MMDNS通过双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)接头（图1A)。多模块DNA聚合物通过三个DNA发夹的两步杂交链式反应整合了mRNA锚定序列poly(T)、CpG ODN、酸性环境响应性富含C序列和DC靶向适配体。同时，作者进行了YY形引发剂、dsDNA接头、以及聚合物的制备工作。MMDNS的构建工作则为，通过将增强绿色荧光蛋白（EGFP mRNA）编码的模型mRNA通过poly(A)和poly(T)杂交连接到DNA聚合物上来制备嵌入mRNA的MMDNS，特别是DNA聚合物中poly(T)与mRNA的摩尔比为25：3。然后添加dsDNA接头以交联复合物并通过poly(A)和poly(T)杂交形成mRNA包埋的MMDNS。经过一系列的表征(图2A-2J)，作者选用了poly(T):dsDNA接头=25:7.5组装的mRNA包埋的MMDNS用于随后的体外和体内实验。此外，文章进一步验证了MMDNS的pH响应组装情况，结果发现，MMDNS是通过形成由酸性环境响应性富含C的序列介导的i基序结构组装的。

图1&2 分子设计与构建

03

MMDNS组装成mRNA区室及mRNA的区室表达

然后，作者将获得的MMDNS递送到活的DC2.4细胞中，以探索酸性溶酶体环境触发的MMDNS组装。作者首先将DC2.4细胞分别用Cyanine5(Cy5)标记的MMDNS和Cy5标记的非C-DNS处理6h和12h，细胞溶酶体同时用Green Lyso Tracker染色。通过激光扫描共聚焦显微镜发现细胞有效摄取MMDNS和非C-DNS(图3B、3C)。同时，根据量化结果显示，MMDNS拥有更强的溶酶体逃逸能力(图3D)，作者假设这一情况是由于在酸性介质中，MMDNS中富含C的序列吸收质子并导致H质子量减少，导致MMDNS通过质子海绵效应逃逸溶酶体。生物TEM的结果进一步验证了MMDNS在溶酶体中的组装(图3E和F)。此外，在细胞质中也观察到聚集体，进一步确认了聚集体具有更强的溶酶体逃逸能力。综合这些结果，作者认为MMDNS的确能够通过C富含序列在酸性溶酶体中组装，从而促进其逃逸溶酶体，随后在细胞质中形成聚集结构。紧接作者将嵌入Cy5-mRNA5-羧基荧光素标记的非C-DNSMMDNSDC2.4细胞一起孵育10h。从LSCM图像发现MMDNS的组装将mRNA局限于非膜结构，因此为mRNA提供了隔室。而Pearson相关系数进一步证实，与非C-DNS组相比，MMDNS处理的细胞中DNA成分和mRNA的相关性更强3H)

图3&4 MMDNS组装成mRNA区室及mRNA的区室表达

在mRNA区室表达的研究中，作者先验证了MMDNS作为mRNA转染载体的可行性。将DC2.4细胞与EGFP mRNA包埋的MMDNS孵育48小时，结果显示56.1%的细胞表达EGFP，显著高于游离mRNA对照组，证实了MMDNS的高效转染能力(图4A、B)。通过免疫荧光染色发现，真核延伸因子eEF2在MMDNS处理组中与MMDNS高度重叠，表明翻译分子集中在区室内(图4D-F)。进一步实验显示，在非C-DNS处理组中，EGFP表达主要分布在细胞质中，而在MMDNS处理组中，EGFP信号主要集中在聚集体区域，并且部分EGFP扩散到细胞质中，表明DNA聚集体为mRNA翻译提供了局部化环境(图4G)。此外，对比不同DNS配方发现，MMDNS处理的细胞荧光强度比非C-DNS组高1.6倍，证明mRNA区室化显著提升了表达效率，而CpG ODNs和DC靶向适配体不影响mRNA表达(图4H)。

04

MMDNS介导体外APC激活与体内CTL反应

为研究MMDNS组装对抗原呈递细胞(Antigen-presenting cell, APC)活化和抗原特异性呈递的影响，将BMDC与游离OVA mRNA和CpG ODNs物理混合物(ii)、非CpG-DNS-OVA mRNA(iii)、非C-DNS-OVA mRNA(iv)、MMDNS-OVA mRNA(v)和MMDNS(vi)分别孵育48h，并将未处理的细胞设置为对照组(i)。流式细胞术分析显示，v组中观察到MHC-II和共刺激分子CD80/86的表达显著增加，表明APCs被有效激活(图5B、C)。酶联免疫吸附测定分析显示，v处理组中BMDC分泌的TNF-α和IL-6和IL-12显著增加(图5D、E)。以上结果表明，MMDNS的组装增强了CpG ODN对BMDC激活的作用。进一步进行OVA肽特异性呈递的流式细胞术分析。与其他组相比，v处理组表现出更高的OVA肽SIINFEKL-H2Kb+复合物(图5G)，溶酶体中MMDNS的细胞内组装促进了APC激活和抗原特异性呈递。综上，MMDNS通过增强APC活化和抗原呈递，显著提升了免疫反应。

图5&6 MMDNS介导体外APC激活与体内CTL反应

为评估体内淋巴递送，用MMDNS-OVA mRNA肌肉注射雌性小鼠，采集腋窝和腹股沟淋巴结以及主要器官进行成像及定量分析，结果显示，MMDNS在淋巴结中的积累效率是非T-DNS的~2倍，两种类型的DNSs都分布在淋巴结内DC中且MMDNS组表现出更强的荧光信号(图6A-D)。进一步研究对淋巴结抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)反应的影响，向小鼠肌肉中注射射了嵌入等效剂量的OVA mRNA和CpG ODNs的不同DNS配方，包括非C-DNS(III)和MMDNS(IV)，或OVA mRNA和CpG ODNs的物理混合物(II)以及对照组(I)组。接种7天后收集注射侧腋窝和腹股沟淋巴结用于APC活化分析，IV处理组中CD80/86+DC的数量增加，且OVA肽呈递DC的百分比显著高于其他组(图6E、F)。同时收集接种疫苗动物的外周血，发现疫苗接种小鼠的细胞表现出更高的IFN-γ+CD8+CTL百分比，表明MMDNS-OVA mRNA引起的CTL反应更强(图6G)。

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MMDNS的抗肿瘤效果与肿瘤转移、复发抑制能力

接下来，利用黑色素瘤模型，作者研究了基于mRNA区室化的疫苗的肿瘤抑制能力，向小鼠体内注射不同制剂的DNS包埋等效剂量的OVA mRNA和CpG ODN，包括上述提到的I、II、III、IV，在接种后第5天和第12天皮下成瘤(图7A)。根据测量肿瘤大小得知，IV处理组的大小和重量均显著减少表明提供隔室的MMDNS组装促进了MMDNS-OVA mRNA的抗肿瘤效率(图7B-D)。免疫荧光及HE染色显示，IV处理组肿瘤组织呈现更多的坏死及CD8+T淋巴细胞浸润(图7E-H)。证实了MMDNS-OVA mRNA通过淋巴结靶向递送和高效的CTL反应，显著抑制了肿瘤生长，并诱导了更强的T淋巴细胞浸润和肿瘤坏死，展现出优异的抗肿瘤效果。

图7&8 MMDNS的抗肿瘤效果与肿瘤转移、复发抑制能力

为评估基于mRNA区室化的疫苗对肺转移的抑制效果，C57BL/6N雌鼠在第0、7和14天分别进行上述组别接种，并在第24天静脉注射B16-OVA肿瘤细胞(图8A)。第50天评估肺转移情况，结果显示，III、IV处理组的肺转移显著减少，其中MMDNS-OVA mRNA组的转移结节最少，表明其具有显著的抗转移效果。H&E染色进一步证实，IV处理组对转移形成的抑制作用最强(图8B-D)。此外，体外用OVA肽重新刺激后，脾脏的免疫激活水平分析显示，IV处理组显著提高了IFN-γ+CTLs的比例和IFN-γ分泌，以及CD8+和CD4+效应记忆T细胞比例均增加。而且生存曲线显示，IV处理组组小鼠的生存期显著延长，50%的小鼠存活超过35天(图8E-L)。综上所述，MMDNS-OVA mRNA能够触发强烈T细胞介导的抗肿瘤免疫，有效抑制肿瘤转移并显著延长小鼠生存期。

06

结语

本研究提出了一种增强mRNA疫苗效果的策略，MMDNS通过DNA杂交链反应精确组装，整合了抗原编码mRNA、CpG ODNs、DC靶向适配体和酸性环境响应性富含C序列。在酸性环境中，MMDNS通过形成i-motif结构组装成微米级聚集体，增强CpG ODN的佐剂效果，激活APC聚集体并逃逸至细胞质，为mRNA提供局部化翻译环境，显著提高mRNA表达效率。实验表明，基于MMDNS的mRNA区室化策略在癌症免疫治疗中具有巨大潜力，能够诱导强烈的肿瘤特异性CTL反应，有效抑制肿瘤生长和肺转移。未来该策略或可发展为通用平台，用于不同mRNA的高效表达和肿瘤免疫治疗。

参考文献

[1] Guo X, Guo M, Cai R, et al. mRNA compartmentalization via multimodule DNA nanostructure assembly augments the immunogenicity and efficacy of cancer mRNA vaccine. Sci Adv. 2024 Nov 22;10(47):eadp3680.

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撰写| RNA星球

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice