T细胞衔接器（TCE）3个月毒理研究的意义—Amgen分享的4个内部真实案例

T细胞衔接器（TCE）主要通过结合CD3，将患者的细胞毒性T细胞与表达特定抗原（如肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原TAA）的靶细胞连接起来。随后形成的溶细胞性突触会诱导依赖靶细胞的多克隆T细胞活化与增殖，最终导致肿瘤靶细胞凋亡。最早获批的TCE为catumaxomab（2009年）和blinatumomab（2014年）；2021-2023年又有7款TCE获批。这些均遵循ICH S6和S9建议，在开展注册性临床试验前，需进行较长期的重复给药毒理学研究。

双特异性T细胞衔接器（BiTE®）分子是TCE的一种，由美国安进公司开发，其将两种不同单克隆抗体的可变区整合到一条多肽链中。在体内同时结合CD3与其特定靶蛋白时，通常在首次给药后48小时内会出现“标志性”效应，包括体温短暂升高、急性期反应（可能伴随细胞因子和C反应蛋白短暂升高）、血液学变化（如淋巴细胞短暂减少）以及T细胞活化迹象等。安进的BiTE®开发策略包括：1）临床前阶段会对人及相关非临床种属中靶TAA进行早期全面的正常组织表达谱分析，综合mRNA、蛋白等相关数据，评估动物在未来非临床安全性研究中的潜在相关性；2）安进的专有CD3结合剂仅与人类和非人灵长类动物（NHP）交叉反应，因此若能与NHP的TAA交叉反应，NHP便是临床BiTE®候选药物测试的唯一具有药理学相关性的毒理研究种属。理想情况下，当NHP与人类的靶标分布相似时，可在NHP中评估分子安全性，以识别潜在的靶器官毒性；若存在表达差异，需考虑NHP对各靶器官安全性的评估能力，对不表达靶标的NHP器官/系统，可能需通过体外等替代方法评估人类安全风险；3）体外系统用于验证新型BiTE®分子在人类和NHP中对效应细胞的衔接作用相似；验证正常组织中靶标表达相当以及T细胞介导的体外活性，以确认NHP是特定BiTE®候选分子的相关动物种属。若无法与NHP的TAA交叉反应，可能开发在NHP或啮齿类动物中具有等效药理活性的替代TCE分子。

多数情况下，探索性2周重复给药研究可生成初步毒代动力学数据并早期识别毒性，为后续1个月GLP重复给药研究（简称“1个月研究”）的剂量选择提供依据，该1个月研究（在NHP中进行，若使用啮齿类替代物则在啮齿类中进行）可支持IND申请。根据ICH S9，在关键的注册性人体临床试验开始前，可在同一种属中补充3个月GLP重复给药毒理学研究（简称“3个月研究”）。依据ICH S9和3R原则（替代、减少、优化），仅当预期出现毒性且无法仅通过受影响靶器官及其生物学特性预测毒性可逆性时，才在研究中设置恢复组。

治疗性蛋白常被免疫系统视为异物，潜在引发抗药物抗体（ADA）反应。人类中治疗性蛋白的免疫原性受蛋白结构、制剂、给药途径、剂量水平、给药频率/持续时间及患者特异性因素等影响，且ADA发生率常呈剂量依赖性增加。噬菌体展示技术的进步和转基因小鼠的应用助力全人源抗体的研发，降低了患者产生ADA的风险。动物用于非临床药效学和安全性研究时，所给药的分子可能被视为异物（人类来源）并诱导ADA。已知用于人类的生物治疗药物在NHP的安全性评估中可能引发ADA，但NHP中的ADA无法预测人类的免疫原性。ADA会从多方面干扰动物毒理学研究的解读：一是结合药物并改变其动力学（如降低暴露量）；二是阻止靶标结合，阻断分子的药理或毒理作用；三是与药物在循环中形成免疫复合物（ICs），可能通过沉积在肾脏（肾小球）、血管、滑膜、肺、肝、皮肤、眼、脉络丛等组织，引发ICs介导的不良事件，导致炎症及后续组织损伤。ICs的形成可能起初较缓慢，但可能进展为包括血小板活化、广泛组织炎症（如血管炎、肾小球肾炎）、临床症状甚至死亡等一系列反应，这会严重影响包括NHP在内的动物种属长期研究的价值。

因此，经验表明，对于BiTE®的开发，1个月研究常能生成有意义的IND支持性安全信息；早期开展3个月研究以支持IND申报，可能因ADA的影响而无法获得有意义的安全信息。

安进公司探讨了BiTE®分子在NHP中的3个月研究相较于短期研究，是否能识别更多非临床安全信号。本研究探讨的关键问题包括：1）在3个月研究期间，NHP中BiTE®分子的暴露是否维持稳定？2）3个月内重复给药BiTE®分子，是否能在1个月研究建立的非临床安全谱基础上提供更多有意义的信息（即对分子的临床应用或开发路径产生影响）？3）可通过哪些论据说服监管机构3个月研究并非必需？

看下安进公司分享的4个内部案例。

案例A：与监管机构达成开展3个月研究的共识

分子A的基本情况及1个月研究结果

分子A靶向血液瘤。在1个月研究中，按0、5、25、125μg/kg的剂量每周对动物进行静脉注射，每组6只（雌雄各半），动物可以耐受。中剂量组和高剂量组观察到了BiTE®分子活性的标志性特征。

与分子A相关的微观观察结果出现在淋巴结（中、高剂量组）和脾脏（仅高剂量组），表现为生发中心轻微增加，具体特征为滤泡生发中心增大、易染体巨噬细胞数量增多。高剂量组生发中心增大与2只雄性动物的肠系膜淋巴结肉眼可见增大以及脾脏重量增加相关。这一变化被解读为可能是对药物相关循环淋巴细胞减少的再生反应，且不被视为不良反应。

低剂量组和中剂量组未出现ADA，但高剂量组100%的动物产生了IgG型ADA，其中67%的动物因ADA导致药物暴露量显著降低（AUC降低15%及以上）。

3个月研究的设计及结果

开展分子A的3个月研究的理由未与任何机构讨论，因为似乎没有充分依据支持这一请求。由于低剂量组和中剂量组动物未产生ADA，且观察到了BiTE®分子活性的标志性特征，因此有潜力在这些剂量水平下评估该分子长期给药的效果。

考虑到ADA发生率常呈剂量依赖性增加，将1个月研究中的中剂量（25μg/kg）作为3个月研究的低剂量，同时采用未测试过的75μg/kg作为高剂量，旨在降低分子的免疫原性。

3个月研究中，仅低剂量组的2只动物在整个研究期间维持了药物暴露；其余所有动物均因ADA形成而导致暴露量下降。因此，尽管治疗周期为3个月，但大多数动物在给药1个月后便未再暴露于分子A。

1个月和3个月研究中与受试物相关的发现：1个月研究中，中剂量组和/或高剂量组观察到腋窝淋巴结、肠系膜淋巴结和脾脏大小轻微增加；而3个月研究中，未发现任何与受试物相关的微观发现，1个月研究中的结果未在长期研究中重现。

结论

分子A的3个月研究未重现1个月研究中的毒理结果，也未见任何新的发现，因此未提供可供临床参考的额外安全信息。ADA的形成导致大多数动物无法持续3个月暴露于药物，在多数情况下实际上形成了非预期的恢复期，即给药在继续，但实际外周很快被清除，没有药物暴露，这也是1个月研究结果未重现的原因。

案例B：监管机构要求开展3个月研究

分子B的基本情况及1个月研究结果

分子B治疗实体瘤。在NHP的1个月研究中，按50、500、4500μg/kg的剂量每周静脉输注给药，每组6只动物（雌雄各半）。动物耐受良好，且观察到了BiTE®分子活性的标志性特征。

中剂量组和高剂量组动物中，分别有60%和100%检测到ADA，其中50%的ADA阳性动物药物暴露量显著降低。主要研究发现为：在ADA阴性的低剂量和中剂量动物中，垂体出现轻微至轻度的混合细胞炎症浸润。尽管高剂量组平均暴露量更高，但该剂量组100%动物均存在IgG型ADA，因此未观察到这一变化。

另有1只动物的心脏和肺出现与血管损伤相关的变化，这与ADA相关免疫复合物可能介导的继发效应一致：心脏中1条冠状动脉周围有肉芽肿性炎症，肺中2条小肺动脉有血栓并部分阻塞管腔。这些变化与分子B并不直接相关，原因是：仅1只动物的少数血管出现该变化，研究中其他动物（包括药物暴露量更高的动物）均无类似血管变化，且该变化与免疫复合物介导的血管损伤特征相符。

与监管机构的沟通及3个月研究的开展背景

安进向监管机构提出申请，认为3个月研究未必能发现更多毒性，原因如下：1）基于BiTE®分子的作用机制，其效应会急性显现，且已在1个月研究中完成评估；2）2周探索性研究和1个月研究已充分表征分子安全性，尽管给药时间延长，但1个月后未出现发现结果的进展；3）结合1个月研究中ADA的形成情况，动物可能无法在3个月研究期间维持稳定的药物暴露。

然而，监管机构认为：1个月研究中虽出现ADA，但对分子B暴露量的影响较小，且主要局限于高剂量组；此外，动物未出现明确的超敏反应迹象，不影响继续给药；同时，尽管1个月研究中的发现极少，但无法排除长期暴露于分子B后出现新发现的可能（即便靶标表达水平预计不会随时间升高），因此要求开展3个月研究。

3个月研究的设计及结果

3个月研究中，按50、4500μg/kg的剂量每周静脉给药，每组8只动物（雌雄各半）。低剂量组和高剂量组动物中分别有75%和50%产生ADA，但所有高剂量组动物及50%的低剂量组动物（2只ADA阳性、2只ADA阴性）均维持了足够的药物暴露。低剂量组中暴露量下降的动物（均为ADA阳性）从第30天起开始出现暴露量降低。

1个月研究中通过光学显微镜观察到的与受试物相关的唯一发现（垂体浸润），在3个月研究中也被观察到，且发生率和严重程度均未增加。在1个月和3个月研究中，这些浸润均表现为混合细胞或单核细胞浸润：1个月研究的生存期结束时，观察到混合细胞浸润（提示急性炎症过程）；而在1个月研究的恢复期结束时及3个月研究的治疗期结束时，观察到单核细胞浸润（与慢性或消退期炎症过程一致）。

此外，在给予分子B的动物中，多个组织观察到发生率增加的微观变化——尽管其组成、严重程度和分布与该物种常见的自发性浸润相似，但仍归因于静脉给予外源性生物治疗药物和/或ADA的存在。这些变化包括：剂量≥50μg/kg时，多个组织出现轻微的单核细胞和/或混合细胞浸润，主要表现为小灶性淋巴细胞浸润，且呈血管周围分布。

结论

分子B在1个月和3个月研究中的发现相似，未发现新的安全信息以支持临床开发。

案例C：不同监管机构要求不同，导致3个月毒理研究的开展

1个月毒理研究情况

C分子是针对实体瘤靶点的药物。NHPs 1个月毒理研究中，每组8只动物，设置0、5、5/15、5/30μg/kg四个剂量组（5/15μg/kg和5/30μg/kg指第1天给药5μg/kg，第5天起给予更高剂量），于第1、5、12、19、26天给药；高剂量组增设恢复组（每组2只/性别）。结果发现，动物可以耐受，呈现出BiTE®分子的典型活性特征。多个组织出现单核细胞至混合细胞浸润及/或炎症，且常呈血管周围分布模式。低、中、高剂量组中，分别有86%、100%、75%的动物产生了ADAs；各剂量组分别有50%、71%、100%的动物出现明显的药物暴露量降低。

关于3个月研究的监管沟通与后续试验

豁免3个月研究的申请及各方意见：以“基于1个月研究数据，预计3个月研究中ADA发生率高，可能导致暴露量损失”“1个月研究中，有ADAs的动物与无ADAs的动物相比，与受试物相关的光镜下发现的发生率和/或严重程度有降低趋势，提示3个月研究中ADA阳性动物可能暴露量降低，甚至在治疗中也可能恢复”为由，请求监管机构豁免ICH S9推荐的3个月研究。最终，两家监管机构同意豁免，一家不同意，其理由是“1个月研究中并非所有动物都产生了ADAs，部分动物可能在3个月给药期间维持暴露量”“ADAs可能影响暴露量，但未必影响活性，3个月研究仍可能为安全性评估提供信息”。

3个月研究的开展及结果

因该分子拟全球销售，安进公司开展了3个月研究，设置5、5/15、5/30μg/kg三个剂量组，所有动物（每组4只/性别）第1天均给予5μg/kg，第5天起每周一次给予5、15或30μg/kg，持续3个月。

药物暴露情况：研究结束时，接受C分子治疗的动物几乎完全丧失药物暴露，24只动物中仅2只（8%）在研究期间维持足够暴露量（低剂量组和高剂量组各1只），其余动物在产生ADAs后从第30天起暴露量降低。

组织病理学发现：两个研究周期结束时，均在各组织中观察到免疫细胞浸润，但3个月研究结束时，多数组织中浸润的发生率或严重程度降低，这归因于治疗第一个月起ADA介导的暴露量长期降低，无意中模拟了恢复期。

结论

与1个月研究相比，3个月研究未发现新的靶组织，未揭示任何新的安全问题，也未发现现有毒理发现的恶化。

案例D：各监管机构完全同意豁免3个月毒理研究

1个月毒性研究情况

D分子是一款治疗血液瘤的BiTE®分子。试验设计：按性别分组，每组6只动物，采用静脉给药方式，于第1、5、12、19、26天给药。设置两个固定剂量组（低剂量组5μg/kg、中剂量组25μg/kg）和一个高剂量组（高剂量组采用初始递增给药方式：第1天5μg/kg，第5天50μg/kg，第8、12、19、26天250μg/kg）。结果如下：

ADA及暴露量情况：第26天，所有受测动物的ADAs均呈阳性；重复给药后，所有动物的药物暴露量均下降。在可测定的情况下，第26天给药后5分钟的血药浓度仅为第1天（低、中剂量组）或第8天（高剂量组）同一时间点浓度的≤3%，表明所有动物的药物暴露量快速降低。

耐受性及病理情况：中剂量组无法耐受，动物死亡和/或濒死的原因是多方面的，包括ADA介导的血小板减少症、骨髓细胞减少和/或菌血症。在可耐受剂量下，主要观察结果包括骨髓细胞减少，以及骨髓、淋巴结和脾脏中淋巴样细胞增多的继发性再生性改变。

PD标志物情况：1个月研究中，以靶RNA作为PD标志物评估该BiTE®分子在NHP中的活性。高剂量组动物在-1周时存在靶mRNA，到第12天显著减少，第29天恢复至基线水平，这表明由于ADA介导的暴露量减少，治疗的药理学作用减弱。

关于3个月研究的监管沟通结果

豁免3个月研究的申请理由：安进公司提出，鉴于1个月研究中ADA发生率高，导致药物暴露量降低，进而使得药理学、药效学和毒理学效应无法显现。此外，PD标志物评估和组织病理学检查表明，因ADAs导致暴露量减少后，相关效应已逆转，因此开展3个月研究不会提升该分子的安全性评估效果。

监管机构意见：由于综合数据集具有充分的说服力，所有被咨询的监管机构均同意豁免D分子的3个月研究要求。

最后

根据ICH S6(R1)）要求，非临床研究的目的包括确定人体初始安全剂量及后续剂量递增方案、识别潜在靶器官毒性、明确动物毒性的可逆性、确定临床监测的安全参数。按照ICH S9描述，对于多数晚期癌症治疗药物，3个月非临床研究被认为足以支持上市，这类亚慢性动物研究旨在揭示短期研究中未发现的潜在安全信号。

TCEs是通过激活T细胞发挥作用，激活过程在给药后数小时内发生，极端情况下可引发严重细胞因子释放综合征。动物毒性研究中，靶组织的靶向效应可在给药后数天至数周内出现，4周内即可充分表征靶器官毒性。因TCEs常快速导致细胞死亡，通常不会在2-3个月治疗后出现关键组织的延迟毒性效应；当然，不排除一些特定情况，如靶标上调、慢性细胞死亡的长期后遗症等。

安进公司分享的4个案例中，3个案例（A-C）开展了NHP 3个月毒理研究，其中A、C案例中，ADAs导致多数动物在研究期间暴露量不足。

A案例中，1个月研究显示有限组织存在轻微发现，但3个月给药后因完全丧失暴露量，未出现任何发现，未为临床开发提供新安全信息；B案例通过“高剂量克服ADA”（即大量给药抵消ADA介导的暴露量损失，维持药效）实现了充分暴露，但1个月与3个月研究对比未发现新毒性；仅C案例的3个月研究有少量额外发现——虽仅2只动物维持3个月暴露。

所以，仅以ADA形成为由申请豁免研究尚不充分，申办方需同时证明ADAs既影响暴露量，也影响药物的药理效应。这一点，案例D做的比较成功，最后所有监管机构同意豁免3个月毒理研究。

安进并非个例，行业普遍质疑ICH S9适应症下TCEs的3个月研究必要性。IQ-DruSafe与IQ3Rs转化预测科学工作组对多家药企的调查显示：TCEs非临床毒性测试中，存在减少NHP使用的机会（不影响数据质量），包括个案豁免3个月研究。部分长期研究并无合理性，且不符合动物伦理。

一些替代方案与实施建议：若3个月研究无额外价值且不符合伦理，可考虑体外实验（如人原代细胞、类器官、器官芯片）。这类方法目前虽然发展迅速，但还需关注下监管机构的接受度；建议早期与监管机构沟通，结合靶标现有数据、类似作用机制研究，采用证据权重法，避免开展无安全信息价值的NHP研究。

还有一点需要注意，监管机构之间意见也会存在不一致。案例C豁免3个月毒理研究的建议得到2家监管机构同意，1家反对。对于拟全球推广的药物，就只能就高不就低，按照要求最高的监管机构意见去落地。

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