Science重磅！“一步到位” ，脂质纳米颗粒改写 CAR-T 治疗格局

CAR-T细胞疗法在治疗B细胞恶性肿瘤方面取得了巨大成功，并且在治疗自身免疫疾病方面也具有潜力。然而，复杂的制造过程和预处理方案限制了其可及性和可扩展性。2025年6月，Capstan公司及宾夕法尼亚大学的研究人员在Science期刊发表了一篇名为《In vivo CAR T cell generation to treat cancer and autoimmune disease》的文章。

该论文介绍了体内（in vivo）CAR-T的临床前实验及结果。通过靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）递送 mRNA，在体内直接将CD8⁺ T细胞重编程为CAR-T细胞，无需复杂的体外制备流程。据啮齿动物和非人灵长类动物（NHP）模型的数据表明，这种疗法可以控制肿瘤。在自身免疫模型中，观察到NHP的血液和组织中B细胞的深度和短暂耗竭，导致“免疫重置”。这种策略可能为体外CAR-T细胞免疫疗法提供一种现成的、非病毒的、可扩展的替代方案，有望突破现有CAR-T疗法的应用局限。

一、技术突破：体内CAR-T如何实现“一步到位”？

1、靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）的创新设计

传统CAR-T疗法需在体外分离、修饰患者T细胞，流程复杂且耗时。而该研究采用靶向脂质纳米颗粒（tLNPs），将编码CAR的mRNA精准递送至体内CD8⁺ T细胞：

tLNPs由五种脂质成分组成，包括可电离脂质（L829）、靶向部分（如抗体）和包裹的mRNA负载物。能减少肝脏等非靶器官的吸收，提高对T细胞的递送效率。

与传统mRNA疫苗的脂质（如ALC-0315）相比，L829脂质在体内清除更快，降低肝毒性，且能减少急性炎症反应（如大鼠模型中急性时相蛋白水平显著降低）。

2、精准靶向CD8⁺ T细胞

通过抗CD8抗体修饰，tLNPs可优先在CD8⁺ T细胞中表达CAR，减少CD4⁺ T细胞的非特异性激活——这一设计能降低细胞因子释放综合征（CRS）风险，而CRS正是现有CAR-T疗法的主要安全隐患。

二、临床前数据结果

1、实现肿瘤消退

在人源化白血病异种移植小鼠模型中，使用CD8-L829-tLNP-CD19治疗的小鼠表现出显著的肿瘤控制效果：30μg剂量下，所有小鼠在第二次给药后3天内均达到完全肿瘤清除，而10 μg剂量下也显示出显著的肿瘤控制效果。此外，治疗后的B细胞在1小时内开始减少，3小时内接近完全消除，且CAR表达在6小时达到峰值，24小时内仍可检测到。

2、免疫重置

在食蟹猴模型中，多次注射CD8-L829-tLNP-CD20导致血液和组织中B细胞的深度和短暂性耗竭：外周血中的B细胞在第21天开始重新出现，在第35天恢复到接近基线的水平，值得注意的是，记忆B细胞几乎被完全清除，治疗后重新出现的B细胞主要表现为幼稚细胞，这提示了它们的免疫系统已被重置。

3、安全性优化

与基准tLNP相比，CD5-L829-tLNP处理的大鼠急性期反应蛋白水平显著降低，且在最高剂量5 mg/kg下未观察到不良反应；在食蟹猴实验中，CD5-L829-tLNP在高达3 mg/kg的剂量下静脉注射，肝脏酶水平较低。

两剂给药方案（间隔72小时）与三剂方案效果相当，表现出良好的安全性和耐受性，且避免了第三剂注射后的 IL-6 水平升高等潜在风险。

图1. 可离子化脂质L829减少了tLNP对肝脏的非靶向传递。

（A）靶向脂质纳米颗粒的示意图。

（B）在用封装荧光素酶mRNA的CD5 tLNP处理后6小时，对野生型C57BL/6小鼠进行生物发光成像。每组显示五只小鼠的代表性图像。图像按0到250,000光子/秒/平方毫米/球面度的比例缩放。

（C）在用CD5 tLNPs处理后指定时间点，对野生型C57BL/6小鼠肝脏组织中的基准和L829脂质进行定量。每组每时间点n=3只小鼠。

（D）在用3.0 mg/kg CD5 tLNP给药后24小时，大鼠血浆中急性期蛋白α1酸性糖蛋白（AGP）、α2巨球蛋白（A2M）和触珠蛋白（HP）的水平。每组n=3只大鼠；样本以双份运行并取平均值。

（E）在用3.0 mg/kg CD5 tLNPs单剂量给药后，食蟹猴血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）的浓度。每组n=2只猴子。

（D）和（E）中的统计分析通过双因素方差分析（ANOVA）进行，随后进行多重比较（***P≤0.001，****P≤0.0001）。正常参考范围以灰色阴影显示。

（F）在野生型C57BL/6小鼠中，静脉注射10μg tLNP后24小时，CD4+和CD8+ T细胞、单核细胞和B细胞中mCherry的表达。每组n=5只小鼠。

（G）在用人类T细胞移植的NOD scid gamma（NSG）小鼠中，静脉注射20μg tLNPs后24小时mCherry的表达。每组tLNP n=3到4只小鼠，1只磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）对照小鼠。数据为平均值±标准差。

图2. 抗CD19 CAR mRNA的改进提高了T细胞中的表达和功能。

（A）测试的CAR设计图。scFv，单链可变片段。

（B）序列改进策略概述。ORF，开放阅读框。

（C）选择和优先考虑mRNA载荷开发候选者的方案流程图。

（D）新鲜激活的人类T细胞用封装不同CAR mRNA序列的tLNP转染。在转染后48小时测量每细胞的抗CD19 CAR分子数（x轴），并与Nalm6肿瘤细胞杀伤（y轴，基于Incucyte的6:1 T细胞与肿瘤细胞比例共培养后的Nalm6肿瘤面积）相关联。每个点代表一个不同的测试构建；用于进一步分析的构建用蓝色圈出。

（E）在扩展的人类T细胞中，原始（基础）和改进的CAR2构建之间的CAR表达比较分析。CAR表达表示为转染后6、24和48小时每细胞CAR分子数的曲线下面积（AUC）。

（F）与指示的靶细胞共培养后的IFNγ表达。K562是CD19阴性对照。

（G）在用人类T细胞移植并携带Nalm6肿瘤的NCG小鼠的脾T细胞中，用10μg CD5-tLNP进行三次剂量处理后，抗CD19 CAR的表达，使用原始或改进的mRNA。每组n=5只小鼠。

（E）和（G）中的统计分析：非配对双尾t检验（*P≤0.05）；（F）中的统计分析：双因素方差分析（ANOVA）与事后多重比较（**P≤0.01，****P≤0.0001）。数据为平均值±标准差。

图3. 包裹B细胞靶向CAR的tLNPs在自身免疫疾病患者样本和人类化小鼠中诱导快速B细胞耗竭。

（A）自身免疫疾病患者和健康供体来源的非激活人类T细胞在体外转染CD8-L829-tLNP-CD19后24小时抗CD19 CAR的表达。

（B）自身免疫疾病患者和健康供体来源的非激活PBMCs在体外转染CD8-L829-tLNP-CD19后72小时B细胞耗竭。杀伤效果以未转染对照组为基准进行标准化。根据单因素方差分析（ANOVA）和事后多重比较，患者和健康供体之间的差异不显著。并非所有

（A）和（B）中的样本都有足够的材料用于两项检测。由于未转染对照组中基线B细胞数量少于100，接受B细胞耗竭治疗的患者样本未纳入此项分析。每个点代表一个不同的供体，除了两名皮肌炎患者和一名健康供体在不同时间点提供了两到三个样本。

（C）在用指定剂量的tLNP处理后24小时，NSG-PBMC小鼠脾脏中人类CD45+细胞中B细胞的百分比。每组n=8（mCherry）或10（抗CD19 CAR）只小鼠。

（D）在用30μg指定tLNPs处理后1、3、6和24小时，NSG-PBMC小鼠脾脏中人类CD45+细胞中B细胞的百分比的时间过程。每组n=5（mCherry）或n=10（CAR）只小鼠。

（E）在用30μg指定tLNPs处理后1、3、6和24小时，NSG-PBMC小鼠脾脏中CD8+ T细胞上CAR的表达。每组n=5（mCherry）或10（CAR）只小鼠。

（F）在用指定tLNP每3天进行三次剂量处理后，NCG-CD34+人类化小鼠循环中人类CD45+细胞中B细胞的百分比。

通过单因素（C）或双因素[（D）和（F）]方差分析（ANOVA）进行统计分析，并进行事后多重比较。（***P≤0.001，****P≤0.0001；ns=不显著，P>0.05）。

（G）在用人类PBMCs移植的人类化NCG小鼠中，用指定tLNP处理后在指定时间点拍摄的Nalm6肿瘤的生物发光成像。CD8-L829-tLNP-mCherry小鼠接受了30μg剂量。小鼠在第-1天被随机分组。每组n=5只小鼠。数据为平均值±标准差。

图4. 包裹B细胞靶向CAR mRNA的tLNPs治疗在食蟹猴中诱导深度B细胞耗竭。

（A）三个独立研究的代表性研究方案，其中食蟹猴每3天接受三次CD8-L829-tLNP-CD20剂量。BioA，ADA和PK测定；BMx，生物标志物；ClinPath，包括全血细胞计数、血清化学和凝血试验的临床病理学；h，小时；PBFC，外周血流式细胞术。

（B）（顶部）在用指定剂量的CD8-L829-tLNP-CD20处理后，食蟹猴血液中B细胞/μl（CD19+和/或CD20+）。剂量用箭头表示。数据来自三项研究的合并。（底部）通过免疫组化染色CD20的代表性脾脏切片显示每个剂量组。脾脏样本分别在第三次剂量后8天（2.0 mg/kg）、7天（PBS、0.5和1.5 mg/kg）或3天（0.1、0.3和1.0 mg/kg）从动物中取出。

（C）在每项研究中，每个剂量组CD8+ T细胞（左侧）和CD4+ T细胞（右侧）上平均表面CAR表达，总共三项研究。相同颜色的单独线条代表来自不同研究的相同剂量组，以考虑研究间不同的时间点和CD20 CAR检测试剂。

图5. tLNP治疗诱导的全球B细胞耗竭后，B细胞谱系恢复时幼稚B细胞占主导地位。

（A）在用1.0 mg/kg CD8-L829-tLNP-CD20处理的两只食蟹猴中，随时间推移血液中B细胞亚群（细胞/μl）的计数。DN，双阴性；IgG，免疫球蛋白G；IgD，免疫球蛋白D。

（B）在最后一次剂量后5周，脾脏中CD20+细胞中B细胞亚群的比例，以及（C）骨髓中B细胞亚群的比例。所展示的数据来自三项研究中的一项，每组n=2只动物。

总的来说，这种体内方法为肿瘤学和自身免疫疾病中B细胞介导的病理学提供了潜在更安全、更易获得的CAR-T疗法的前景，为CAR-T细胞治疗B细胞恶性肿瘤及自身免疫疾病提供一种新方案。

参考资料：Theresa L. Hunter et al. ,In vivo CAR T cell generation to treat cancer and autoimmune disease.Science388,1311-1317(2025).DOI:10.1126/science.ads8473.

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