Kidney Int丨刘志红团队揭示内质网应激调控新机制，提出糖尿病肾病干预新策略

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN） 是 全世界范围内导致慢性肾功能不全的最常见病因 ，而肾小管损伤是DN发生发展的关键环节。虽然近年来DN的临床治疗药物取得了长足发展，但是目前仍缺乏 靶向性的 分子干预手段， 导致 患者长期预后不良。

肾小管损伤是DN发生发展关键环节。 既往研究表明， 内质网应激 是导致高糖介导 肾小管 细胞 损伤 的重要驱动因素 。 DN 患者的 肾小管细胞 存在蛋 白超负荷，大量蛋白质和脂质 被 肾小管细胞 重吸收 ， 导致 其 对各种功能蛋白和膜成分需求增加；此外，高糖 还可以 导致 肾小管细胞中蛋白质非酶糖基化和 大量产生 活性氧， 使得 肾小管上皮细胞 内质网 需要合成更多蛋白质 以 维持细胞功能 。 在这些 压力刺激 综合作用 下， 肾小管细胞 的 内质网 蛋白质 合成质控 能力 受损 ，引发以错误折叠或未折叠蛋白质积累为特征的 内质网 应激 （ER应激） 的 过度激活， 启动细胞凋亡程序，诱导细胞死亡。 虽然目前研究初步证明了 内质网 应激参与 了 高糖情况下的肾小管细胞损伤，但 其 关键调控机制 尚未完全阐明；此外， 靶向内质网应激是否可以作为DN 治疗的 新策略 也需要进一步验证 。

近日，东部战区总医院 ，国家慢性 肾病 临床医学研究中心刘志红院士团队 在肾脏病领域期刊Kidney International在线 发表 了 题为 Protein UHRF1-mediated dual dysregulation of molecular chaperone GRP78 induces endoplasmic reticulum stress and aggravates diabetic nephropathy 的研究论文。该研究发现，高糖可导致肾小管细胞内UHRF1蛋白表达下调，进而破坏其对内质网未折叠蛋白反应中关键分子伴侣—GRP78启动子甲基化及蛋白泛素化的双重表观调控作用，引起GRP78蛋白在肾小管细胞内异常蓄积。机制研究证实，胞质内异常蓄积的GRP78可以通过核孔蛋白复合体介导的细胞核易位，发挥转录调控功能，主动激活内质网应激与细胞凋亡相关基因网络，加剧高糖诱导的细胞损伤。在阐明内质网应激调控新机制的基础上，研究团队结合分子对接与深度学习技术，筛选并验证了可特异性阻断GRP78入核，从而缓解内质网应激反应，减轻DN肾小管损伤的干预新药物。 该 研究 系统 揭示 了 GRP78 表达受到双重 表观遗传调控 及其参与 细胞内质网应激 调控的分子机制；在阐明 DN 肾小管细胞损伤 新 机制 的基础上， 构建和 验证了靶向内质网应激 的 DN 治疗 新策略 。

图1 : 研究 模式 图 。

发现 UHRF1对GRP78的双重 表观 调控 机制

研究团队 利用长期高糖刺激 HK-2 细胞 ，通过 RNA测序验证了持续代谢压力刺激情况下，肾小管细胞内的内质网应激相关通路发生显著激活，其中GRP78是表达变化最为显著的分子。 GRP78 在 DN患者肾小管上皮细胞 中富集表达，且 与正常对照相比，其蛋白和mRNA表达均显著上调。体外研究证实，HK-2细胞中过表达GRP78，可以诱导 内质网 应激通路激活。 研究团队进一步发现，DN患者肾小管细胞内UHRF1表达与GRP78表达呈显著负相关，且体外过表达UHRF1可以显著降低GRP78的mRNA和蛋白表达水平。机制 研究 发现 ， 正常生理情况下， UHRF1 一方面可以 通过 其Hemi- m CpG 和 H3K9me2/3结合 活性 介导 的GRP78基因 启动子甲基化 发挥 转录抑制 的作用，维持 GRP78 mRNA表达稳定；另一方面，UHRF1蛋白可以和GRP78蛋白SBD结构域直接结合，并作为 E3泛素连接酶 ， 介导GRP78 K48连接 的 多聚泛素化 ，从而维持GRP78蛋白表达稳定。 高糖 情况下， 肾小管细胞内UHRF1下调，破坏了其对GRP78启动子甲基化及蛋白泛素化的双重表观调控功能， 导致 了 GRP78 在细胞内的表达增加和异常蓄积 。

图 2 ： UHRF1 与 GRP78启动子 和 蛋白 相互作用 。

揭示 GRP78核 易位 调控内质网 应激 参与DN 肾小管 损伤 新机制

既往研究 认为 GRP78是细胞内质网应激激活的关键标志物，但 缺乏对 GRP78主动参与内质网应激的调控机制 的认识 。研究团队通过DN患者肾组织免疫组化染色和体外细胞实验， 首次发现 高糖不仅可以 诱导 GRP78 在 细胞质中高表达，且可 进一步导致 GRP78入核发生核易位。蛋白 结构解析发现，GRP78 存在不同物种间高度 保守的赖氨酸富集区（氨基酸276-287） 所 构成 的 核定位信号（NLS） ，NLS突变的GRP78会丧失核易位功能。通过 核提取物免疫共沉淀结合质谱技术 和 分子对接模拟 ， 研究团队 解析了G RP 78的 NLS肽段（276-287残基） 可以 与细胞 核转运蛋白Importin β1（KPNB1）的结合口袋形成特异性互作， 从而 驱动 其 核 易位 的发生； 并证明了GRP78 核易位是 其在细胞质内 过表达 所 触发的主动过程，而非核转运系统功能障碍或内质网滞留信号受损所致 。 为了揭示GRP78核易位后的作用，研究团队 采用 CUT&Tag 技术绘制 了 HK-2 细胞中 GRP78-DNA 互作全景图谱 ， 证明了 核 易位 后的 GRP78 主要结合到 内质网蛋白加工（如 ATF6 、 XBP1 、 RIPK1 ）和凋亡通路（如 CASP3 ）的关键调控基因启动子区域， 并显著增加上述关键基因表达水平，从而加重内质网应激。 研究 结果 证明了 GRP78 可以通过核易位， 直接结合靶基因启动子区域 ，从而发挥调控内质网 应激 介导细胞 凋亡 的 级联反应 ，阐明了 DN 肾小管细胞损伤的新机制。

构建靶向内质网应激的糖尿病肾病干预新策略

在阐明 GRP78 核易位加重高糖情况下内质网应激参与DN肾小管损伤机制的基础上，研究团队构建了靶向内质网应激的干预新策略。研究团队通过 蛋白 结构导向分子对接与序列深度学习 相 结合 的筛选策略 ， 从210万种化合物库 中，高通量的筛选了可以特异性靶向GRP78入核序列（NLS）的小分子药物，并进一步验证了通过阻断GRP78入核调控内质网应激治疗DN这一新策略的有效性。

研究团队 虚拟筛选出 酚苷类小分子 Parishin 可以靶向结合到GRP78 NLS区域。体外细胞实验发现， Parishin 处理可以 显著 抑制高糖诱导的GRP78入核，但是并不改变GRP78在细胞质内的表达水平。研究显示， Parishin 通过特异性阻断GRP78与核转运蛋白Importin β1的相互作用， 从而抑制其 核 易位 。体内外研究证实， Parishin 治疗 可以 在不改变 db / db 小鼠体重和血糖的情况下，有效缓解 db / db 小鼠肾小管间质的内质网应激，并且抑制细胞凋亡信号通路，改善 db / db 小鼠模型的肾小管损伤和间质纤维化。 研究结果证明了靶向 GRP78核 易位的 内质网应激 干预新策略有望作为DN治疗新手段。

研究意义：

（1） 解析 代谢因素 介导 内质网应激的表观调控新机制

高糖等代谢 压力是驱动 内质网应激 的关键因素 。本研究 揭示了 高糖 介导的 UHRF1 变化调控 内质网应激关键分子 伴侣— GRP78的DNA甲基化与 蛋白 泛素化修饰 的分子 机制。 该 发现不仅为理解 DN 中内质网应激的分子调控机制提供了新视角，也为 解析表观调控机制参与 DN 发生发展提供了理论依据。

（2） 阐明GRP78 调控内质网应激的关键 机制

本研究系统揭示了GRP78通过其核定位信号（NLS）与核孔复合物结合并发生核易位的具体机制，并阐明了该过程在调控内质网应激和促进细胞凋亡中的关键作用。 这一发现证实了 GRP78 可以通过 主动入核 过程 ，调控内质网应激关键效应基因的表达，直接参与 和 放大 内质网 应激 过程 ， 这 不仅为 DN的 治疗提供了干预 新 靶点，也为 未来防治其他 内质网应激 所 参与 的 疾病 ， 如神经退行性疾病、代谢综合征等 提供了 新 路径 。

（ 3 ） 靶向GRP78核 易位 为DN治疗提供新策略

与传统GRP78抑制剂 ， 如HA15抑制 GRP78的 ATP酶活性 进而 阻断 其 分子伴侣功能，导致错误折叠蛋白积聚 ， 加剧内质网应激并诱导细胞凋亡的作用机制不同 ， 本研究基于对GRP78核易位反馈激活内质网应激机制的深入解析，筛选出靶向GRP78核定位信号（NLS）的小分子干预药物。该药物 可以在 不干扰GRP78生理性分子伴侣功能的 同时 ，精准抑制 GRP78的 核 易位 ， 从而 有效缓解 内质网应激和 肾小管细胞损伤， 为 DN 治疗提供了 一种兼具靶向性与安全性的治疗新策略。

综上所述，本研究不仅揭示了高糖 介导 肾小管细胞中GRP78 表达 稳态失衡的双重表观遗传调控机制，还 系统 阐释了GRP78通过核易位主动调控内质网应激并介导DN肾小管损伤的关键分子通路 ；基于上述机制，构建和 验证了靶向内质网应激的 DN 干预 新 策略，展现出 了良好的 临床转化潜力与应用价值。

东部战区总医院 国家慢性肾病临床医学研究中心 刘志红院士、 蒋松 主任医师 为论文的共同通讯作者 ； 博士后 杨瑞祥 为 论文的第一作者。

论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0085253825006544

制版人：十一

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