神经环路应用（3）：光学透明化椎间窗对小鼠脊髓进行活体成像

脊髓是中枢神经系统的重要组成部分，承担着神经信号传导和神经调节等关键功能。在脊髓损伤、神经退行性疾病（如多发性硬化症等）中，脊髓内的细胞结构和功能会发生显著变化。然而，由于脊髓的特殊生理位置和复杂的组织结构，对其进行活体状态下的研究面临诸多挑战，传统的研究方法（如组织切片等）难以捕捉到脊髓内细胞的动态变化过程。随着光学成像技术的不断进步，如双光子荧光成像（TPEF）、受激拉曼散射成像（SRS）等技术的出现为在体观察生物组织内部结构和细胞动态提供了可能。同时，基因编辑技术的发展使得可以通过构建转基因动物，对特定细胞类型进行荧光标记，进一步推动了活体成像研究的发展。但如何将这些技术有效应用于脊髓研究以解决上述提到的问题，仍需要不断探索和优化实验方法。

Fig1光学透明化的椎间窗对小鼠脊髓进行活体成像

采用Thy1-YFP-H×CX3CR1GFP/+双转基因小鼠，Thy1-YFP-H使有髓轴突特异性表达黄色荧光蛋白（YFP），CX3CR1GFP/+让小胶质细胞特异性表达绿色荧光蛋白（GFP），实现两类细胞在活体脊髓中双色可视化，为观察二者互作提供基础。

光学透明椎间窗口（Optically cleared IWLF）制备：

• 术前准备

麻醉小鼠，剃除手术区域（T11-T13椎骨对应背部）毛发，用碘伏消毒皮肤，建立无菌操作环境。该步骤保障手术区域清洁，避免感染干扰后续成像及细胞状态。

• 椎骨暴露与固定

在T11-T13椎骨上方做小切口，逐层分离暴露椎骨；移除椎骨表面及两侧肌肉、肌腱，用定制稳定台的夹持杆固定椎骨，维持脊髓成像区域稳定。

关键：保留黄韧带（LF）完整，它是维持脊髓局部微环境、避免手术引发免疫激活（如小胶质细胞异常形态改变）的核心结构。

• 脊髓窗口构建

轻柔清理T12-T13椎间隙内残留肌肉/肌腱，暴露被黄韧带覆盖的脊髓；手术全程避免触碰脊髓及窗口表面，防止物理损伤。向脊髓与盖玻片（置于夹持杆）的0.5-1mm间隙注入碘克沙醇，利用其光学透明特性消除组织散射，为双光子/受激拉曼成像提供清晰光路。

• 成像辅助（如需观察微血管）

成像前，经小鼠眶后静脉注射50μl德克萨斯红葡聚糖（70kDa，1mg/100μl生理盐水）使微血管被荧光标记，拓展成像观察维度。

脑声常谈建立了多个《动物模型构建与行为评估》交流群，群内分享各种经典和前沿的行为范式，共同交流解决动物实验中遇到的棘手问题，避坑少走弯路！有需要的老师可以扫码添加微信进入讨论群！

活体成像操作

• 设备与模式

采用双光子荧光（TPEF）+受激拉曼散射（SRS）成像系统：TPEF用于捕捉YFP（轴突）、GFP（小胶质细胞）荧光信号；SRS利用髓鞘拉曼峰（2863.5cm⁻¹）精准定位朗飞氏结（NR），交叉验证成像区域。

优势：多模态成像结合，既看细胞动态（TPEF）又精准锚定结构（SRS），解决生理互作研究需精准定位轴突功能区的难题。

• 动态成像采集

按时间序列（0-3分钟等间隔）采集荧光图像，记录小胶质细胞突起（初级/次级）与轴突（含NR）的接触、脱离过程，获取细胞互作动态数据。

操作要点：保持成像参数稳定（激光功率、扫描速度等），减少人为误差；设置合理时间间隔（如分钟级），平衡“捕捉动态”与“避免光损伤”。

数据量化分析：

• 接触模式分类

人工/半自动标注图像中“小胶质细胞-轴突接触事件”，区分间歇性接触（小胶质细胞突起短暂附着后脱离）与持续性接触（接触持续数分钟至数小时）。

统计不同接触模式占比，关联小胶质细胞结构（次级突起主导间歇性接触，初级突起/胞体参与持续性接触），解析结构-功能关联。

• 时间动态量化

以“单个朗飞氏结（NR）”为单位，绘制时间轴（横轴，分钟）×接触状态（纵轴，有/无接触）的矩阵图，统计有接触的NR占比随时间变化曲线。

术后与重复成像（可选流程）

• 单次成像后处理：

移除碘克沙醇，用生理盐水冲洗；涂抹液态Kwik-Sil固化保护窗口，缝合皮肤并涂聚维酮碘预防感染；小鼠置于加热垫复苏，单独饲养。

• 重复成像操作：

再次成像时，剪开皮肤、移除固化Kwik-Sil；剥离椎骨新生组织，确保夹持稳定；清理肉芽组织、重新暴露黄韧带，重复光学透明-成像流程，实现长期活体追踪。

总结

创新点：在“保留黄韧带、避免免疫激活”的前提下，实现脊髓内小胶质细胞-轴突（朗飞氏结）动态互作的活体可视化，解决传统方法（如固定组织切片）无法捕捉生理状态下细胞实时行为的痛点。 应用场景：为研究“神经-胶质互作的生理机制、损伤后响应模式”提供关键技术，后续可拓展至脊髓损伤、神经退行性疾病模型，解析小胶质细胞的保护/损伤作用机制。

注意事项：

在构建光学透明椎间窗口或其他暴露脊髓的操作中，容易对脊髓组织造成物理损伤，如穿刺、挤压等，进而影响脊髓的正常功能和成像结果。此外，去除椎骨周围肌肉和肌腱等组织时，若操作不当可能破坏脊髓的血供，导致局部缺血缺氧，影响细胞活性；

窗口稳定性维持：

为了实现长期、多次的活体成像，需要确保窗口的稳定性。但在实验过程中，窗口材料（如盖玻片等）可能会发生移位、污染，影响成像质量；而且窗口与脊髓组织之间的光学介质（如碘克沙醇）若流失或变质，也会降低光学透明度，干扰成像效果。

文献引用

Wu, W., He, Y., Chen, Y. et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun 15, 8837 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-53218-0

脑声小店基于深度科研洞察，专注为动物实验提供"简器械·精实验"解决方案。我们突破高精设备局限，开发手工定制化仪器及配件，通过科研巧思将基础工具转化为创新实验方案。产品涵盖行为学装置、操作辅助工具等，使实验室在保持操作简效的同时，实现精细化数据采集，助力科研人员以创造性思维发掘简易仪器的潜在科研价值。