斑节对虾，真的不会感染EHP？这项研究，跟你说清楚了！

虾肝肠胞虫 （EHP） 是肝胰小孢子 （HPM） 的病原体，严重影响养殖对虾，尤其是南美白对虾。虽然在白对虾养殖中，EHP的爆发趋势有越来越明显，但目前EHP对斑节对虾的致病性数据有限。因此，本研究旨在通过EHP感染检测比较两种虾的易感性。

在实验之前，检查实验虾是否没有被EHP和WSSV感染，保证选择健康的个体。斑节对虾（2±0. 1g）和南美白对虾（2±0.05g），各20尾。实验在100 LFRP罐中持续实验90天，使用过滤海水，pH8±0.3，温度28°C，盐度28 ppt。根据Kuma 等人 （2022b） 对虾进行口服感染：感染组饲喂受EHP感染的肝胰混合饲料（1：1比例）4天，每天2次，相当于体重的5%；对照组使用商业饲料。前7天收集粪便并储存在4°C下。 在感染后15、30、60和90天采集肝胰标本 （n = 3） 进行显微镜检查、ISH和qPCR分析，并且，每周监测生存率和生长速度。

一、通过光学和组织学显微镜观察：

对虾进行无菌解剖，取新鲜的肝胰腺和粪便纤维作为钙荧光白色染色标本（CFW：KOH，1：1），并在荧光显微镜（EVOS，Thermo Fisher）下观察。将肝胰腺组织样本固定在戴维森AFA溶液中，经Bell & Lightner （1988） 处理，切片 （4um），用H&E染色，并在光学显微镜下观察（Nikon Eclipse E200）。

图1：感染后15天（A1）、感染后30天（A2）、感染后60天（A3）、感染后90天（A4）感染EHP的斑节对虾肝胰腺（HP）的组织学切片和感染后15天（B1）、感染后30天（B2）、感染后60天（B3）、感染后90天（B4）感染EHP的白对虾的组织学切片。A2和A3显示HP小管坏死（圆形，x 100）。A4显示HP小管上皮变薄（直箭头，x100）。B1，B2，B3，B4显示HP小管严重坏死（圆形，X 100）。 B1显示上皮细胞脱离（箭头，x 100），B4显示血细胞感染（箭头，x 100）。B2、B3显示HP导管从基底膜变性和脱离（箭头，x 100）。

1、DNA提取、PCR和qPCR：

通过CTAB法提取肝胰腺和粪便纤维中的DNA，用纳米光度计定量并储存在20°C。PCR使用SWP孢子基因特异性引物（Jaroenlak等人，2016）。在1.5%琼脂糖凝胶上分析PCR产物。使用Kumar等人（2022a）的方法进行qPCR，使用StepOne（Applied Biosystems）系统和稀释质粒DNA的参考系。

2、原位杂交 （ISH）：

ISH跟随Rajendran等人（2016）使用DIG标记的SWP-PCR探针。对组织进行处理、去对羟基纤维化、消化蛋白酶K，然后在42°C下与探针杂交混合。结果用碱性磷酸酶偶联的抗DIG抗体和BCIP/NBT底物呈现，然后用俾斯麦布朗Y进行背景染色。

3、跟踪增长和生存率：

每天监测生存率，每周测量体重。生长指标包括：平均体重（ABW）、平均日生长（ADG）、体重增加、比生长率（SGR）、肝脏指数（HSI）和生存率。

图2：感染后90天受EHP攻击的虾肝胰腺 （HP） 的组织学切片（A1-斑节对虾；A2-白对虾）。A1显示EHP的发育阶段（直箭头，x 1000）。A2显示发育的第二阶段（直箭头，x 1000）、颗粒状（星形，x 1,000）、严重坏死（圆形 x 1,000）和孢子状结构（方形，x 1,000）。

二、结果：

1、组织学观察结果：

用植物细胞壁钙荧光白(（CFW）染色的EHP感染虾的肝胰腺在不同样本采集时间显示孢子的存在。在斑节对虾虾中，肝胰组织学记录到30和60 dpc时有轻度病变，伴有导管坏死[图1A2、A3]，在90 dpc时有病变（图2A1）和肾小管上皮退化（图1A4）。

相比之下，南美白对虾在整个实验过程中表现出更严重的病变，包括变性、导管坏死、上皮脱离和血细胞感染（图1B1-B4）。还观察到EHP发育的多个阶段，例如：前期感染阶段、颗粒和孢子阶段（图2A2）。

这两个物种的新鲜肝胰腺标本都表现出特征性的聚集的转化微绒毛（ATM）样结构[图2B1、B2]。ISH在90 dpc时在白对虾中显示出明显的阳性信号，而斑节对虾没有可检测到的信号（图2C1、C2）。CFW染色还显示白对虾的孢子密度明显高于斑节对虾（图3A、B）。

图3：植物细胞壁钙荧光白染色显示，与上皮细胞细胞质中大量孢子（红星，x 1,000）和EHP感染的HP组织。

2、PCR和qPCR结果：

感染EHP的南美白对虾，在采用PCR检测，7天后显示出EHP阳性结果，而斑节对虾（P. monodon）发现呈阳性较晚。该结果在整个实验期间保持在90 dpc（图4），对照组的EHP始终呈阴性。

qPCR分析显示，斑节对虾的EHP载量随时间增加，范围为5.6–10.3x103拷贝/uL的DNA，峰值为60dpc（9.0–12.6x103），其次是90dpc（7.5–10.8x103）、15dpc（5.8–7.0x103）和30 dpc（4.8–6.4x103）。同时，南美白对虾中的EHP载量明显更高，从1.5–5.3x105拷贝/uL的DNA。 最高水平记录在90 dpc （4.0–6.3x105） 时，其次是60dpc（2.0–3.4x105）、15dpc（1.0–2.4x105） 和30dpc（1.0–2.2x105）。结果表明，南美白对虾明显高于斑节对虾的EHP负荷（图5）。

图4：SWP-PCR从15（A）、30（B）、60（C）和90（天）感染EHP的斑节对虾（M1、M2、M3）和南美白对虾（V1、V2）的肝胰腺DNA。

图5：实验感染的斑节对虾和南美白对虾在15、30、60和90 dpc的不同时间间隔的EHP负荷。

图6：在试验期间（感染后90天），斑节对虾和南美白对虾感染EHP和对照组（未感染）的生长性能。

3、实验虾的生长和成活率：

感染后90d（dpc）EHP感染斑节对虾（4.48±0.16g）和EHP感染白对虾（7.05±0.07g）均较对照组（5.23±0.14g）和（9.22±0.16g）明显下降。斑节对虾和白对虾的体重增加（AW）分别为2.47±0.21 g和5.01±0.12 g，低于对照组（3.23±0.19g）和7.26±0.22g。

感染的斑节对虾比生长速率（SGR）（0.89±0.07%/d）低于对照组（1.07 ± 0.06%/d），但无统计学意义（P > 0.05）。同时，感染白对虾的SGR（1.37 ± 0.79%/d）明显低于对照组（1.72±0.05%/d）。

感染斑节对虾和白对虾的平均日生长率（ADG）分别为27.4±2.3 mg和55.6 ± 1.4 mg，明显低于对照组（35.9±2.1mg和80.6±2.5mg）。EHP感染后，两种虾的肝体指数（HSI）也呈下降趋势：斑节对虾（4.60 ± 0.85%）与对照组（4.74±0.38%）相比，白对虾（5.32±0.55%）与对照组（5.90±0.12%）相比。

受感染斑节对虾的存活率（75±12.50%）明显低于对照组（79.16±14.43%）。然而，与对照组（62.5±0%）相比，受感染白对虾的存活率急剧下降（37.5±17.60%），尽管这种差异也没有达到统计学意义的水平，各组之间的大小差异如图7所示。

图7：（A1）对照组（未感染）和（A2）被EHP感染的斑节对虾与（B1）对照组（未感染）白对虾和（B2）被EHP感染的白对虾在90 dpc下的生长速度和大小比较。

三、结论：

本研究是斑节对虾感染EHP的首次报告。结果表明，尽管斑节对虾虾有可能感染EHP，但在载量、组织学病变和原位杂交信号方面的影响水平显著低于白对虾。因此。使用无病原体的斑节对虾（SPF）虾苗后，以及严格的管理措施可能是将EHP对水产养殖的影响降至最低的可行策略。然而，需要进一步的研究来阐明两个物种之间易感性和病理表达差异的潜在生物学机制。