专家视角：优化细胞系开发流程，提升生物制药强化生产效率

摘要：在生物制药领域，治疗性单克隆抗体（mAb）的生产技术不断革新。传统流加培养（fed-batch）虽仍是主流生产工艺，但灌注培养（perfusion）等强化生产工艺因能持续收获产物、减少产物降解等优势，逐渐受到行业关注。然而，目前多数用于灌注工艺的细胞系仍是通过传统流加培养细胞系开发（CLD）流程获得后再进行适应性改造，这种方式存在明显不足。 本研究通过设计两种不同的细胞系开发流程 —— 传统流加培养 CLD 流程与新型灌注培养 CLD 流程，以中国仓鼠卵巢（CHO）细胞为研究对象，系统对比了两种流程开发的细胞系在流加培养和灌注培养工艺中的性能。结果表明，灌注培养 CLD 流程通过采用灌注专用培养基、更精准模拟灌注工艺的缩小模型以及灌注特异性筛选标准，开发出的细胞系在灌注培养中表现出更高的比生产力（qP）、体积生产力（VolP）和细胞稳定性，总蛋白产量提升 16%，且产物质量属性（如糖基化、电荷变异）无显著差异。该研究为生物制药行业优化细胞系开发、推动强化生产工艺应用提供了关键技术支撑，有望降低生物制药成本，让更多患者获得可负担的治疗药物。

1、引言：生物制药生产工艺的演进与细胞系开发的挑战 1.1 治疗性单克隆抗体制备技术的发展历程

自 1986 年首个治疗性单克隆抗体（mAb）OKT3 通过小鼠腹水法生产并获美国食品药品监督管理局（FDA）批准以来，生物制药行业经历了翻天覆地的变革。随着现代重组 DNA 技术的发展与简化，如今超过半数的获批生物制剂依赖永生化哺乳动物细胞系生产，其中中国仓鼠卵巢（CHO）细胞凭借其高表达能力、良好的产物质量控制及安全性，成为应用最广泛的宿主细胞（图 1 为细胞系开发流程概览，包含流加培养与灌注培养 CLD 流程的关键阶段）。

早期重组细胞培养系统面临诸多挑战，抗体表达水平通常低于 1g/L，为满足生产需求，企业不得不建设可容纳 10,000L 以上生物反应器的生产设施。过去数十年间，生物制造领域在硬件（如生物反应器设计）、软件（如工艺控制算法）方面持续改进，建立了稳健的模板化工艺，只需对不同单克隆抗体生产工艺进行细微调整，即可实现生产效率最大化。

1.2 主流生产工艺：流加培养的优势与局限

目前，流加培养（fed-batch） 是生物制药行业最主流的生产工艺，其核心优势在于工艺简单、适配现有生产设施架构，且能实现较高的体积生产力（VolP）。流加培养的基本流程为：细胞在支持对数生长期的基础培养基中培养，随后通过优化的批量补料策略添加浓缩补料液，在支持细胞生长的同时最大化单克隆抗体产量。

然而，流加培养存在显著局限：整个工艺周期（通常超过 14 天）内，所有细胞培养成分均留在生物反应器中，导致单克隆抗体、活细胞不断积累的同时，死细胞、细胞碎片、泄漏的胞内蛋白及毒性副产物也随之增加。这些物质会抑制细胞生长、降低抗体产量，并对产物质量产生负面影响。随着治疗性抗体形式日益复杂（如双特异性抗体），流加培养的上述问题将更为突出。

1.3 新兴趋势：灌注培养的优势与细胞系开发的痛点

近年来，行业开始积极探索灌注培养（perfusion） 等强化生产工艺的潜力。与流加培养通过定时补料解决培养基营养不足不同，灌注培养通过持续输入新鲜培养基、同时移除含产物的废培养基（即产物收获），实现高活细胞密度（VCD）和长时间细胞活力维持。这种工艺有两大核心优势：一是缩短药物产物暴露于蛋白水解酶和氧化还原蛋白的时间，减少产物降解与变性；二是便于实现连续生产，有望缩小生产设施规模，降低制造成本。

尽管灌注培养优势显著，但细胞系开发（CLD）流程的优化却未跟上工艺革新的步伐。目前行业普遍做法是将为流加培养开发的细胞系直接改造用于灌注培养，忽视了两种工艺对细胞特性的不同需求：流加培养需细胞具备高体积生产力（通常由高细胞密度驱动），而灌注培养则更需要细胞具备高比生产力（qP）和适度生长速率。这种 “复用” 细胞系的做法，可能导致灌注培养工艺效率低下。因此，本研究旨在探索通过优化 CLD 流程，开发更适配灌注培养的细胞系。

二、研究方法：两种细胞系开发流程的设计与实施

本研究以CHOZN® GS⁻/⁻细胞为宿主细胞，通过设计 “流加培养 CLD 流程” 与 “灌注培养 CLD 流程”，系统对比两种流程开发的细胞系在不同工艺中的性能。研究分为四个核心阶段：迷你池（minipool）构建与筛选、单细胞克隆、生物反应器评估及克隆稳定性检测，具体方法如下。

2.1 转染与迷你池筛选 2.1.1 细胞转染与筛选

将含谷氨酰胺合成酶（GS）、IgG1 重链和轻链编码序列的重组质粒转染至 CHOZN® GS⁻/⁻细胞。转染后，通过离心去除含谷氨酰胺的培养基，将细胞重悬于无谷氨酰胺培养基中，以 5000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板进行迷你池筛选（依赖 GS 基因实现筛选压力）。24 天后，92% 的孔中观察到细胞生长（共接种 560 个迷你池）。

2.1.2 7 天静态 assay 与迷你池初筛

将生长良好的迷你池传代至两个 96 孔板，一个用于细胞扩增，另一个进行 7 天静态 assay（评估生产力的首次筛选）。结果显示，有细胞生长的孔中，体积生产力（VolP）范围为 0.1-72.9μg/mL（补充图 1），选取 VolP≥9.1μg/mL 的前 40 个迷你池进行后续实验。

2.2 两种 CLD 流程的核心差异

研究设计的两种 CLD 流程在培养基选择、缩小模型（scale-down model） 和筛选标准上存在关键差异，具体如下表所示：

2.3 迷你池的批量、流加与半灌注 assay

将前 40 个迷你池分为两组，分别采用两种流程的培养基和 assay 进行评估：

流加培养组：使用流加专用培养基，在 TubeSpin® 生物反应器管中进行 14 天流加培养 assay，补料采用 EX-CELL® Advanced CHO Feed 1 与 Cellvento® 4Feed 的混合液，监测细胞活力、VCD、VolP 等指标。

灌注培养组：使用灌注专用培养基，在 24 深孔板中进行 5 天半灌注 assay（每日培养基交换率 0.5 vessel volume/day，VVD），除监测活力、VCD、VolP 外，重点评估比生产力（qP）—— 该指标能消除细胞密度和培养基交换率差异，更准确反映灌注工艺中细胞的生产力。

2.4 单细胞克隆与克隆筛选

从两种流程的迷你池筛选中，各选取前 5 个表现最优的迷你池进行单细胞克隆（通过 SONY FX500 流式细胞分选仪实现单克隆化）。克隆生长至 80% 汇合度后，进行 7 天静态 assay，分别选取流加培养组前 80 个克隆、灌注培养组前 160 个克隆进行后续放大筛选（部分克隆因无法适应放大培养被淘汰，最终流加组 77 个、灌注组 152 个克隆进入下一步）。

2.5 生物反应器评估与稳定性检测

缩小模型验证：将筛选出的克隆分别在 96 深孔板流加 assay 和半灌注 assay 中验证性能，选取前 20 个克隆进行放大。

微生物反应器与 3L 生物反应器验证：使用 Mobius® breez 微生物反应器（1VVD 灌注速率）和 3L 玻璃生物反应器，对比两种流程开发的克隆在灌注工艺中的性能（包括 VCD、VolP、qP、产物质量）。

稳定性检测：将克隆连续传代 20 代（约 60 个群体倍增数），通过对比传代前（P0）和传代后（P20）在半灌注 assay 中的 VCD、VolP、qP，评估克隆稳定性（偏差≤20% 视为稳定）。

三、研究结果：灌注培养 CLD 流程显著提升细胞系性能 3.1 迷你池阶段：培养基与 assay 类型影响迷你池筛选结果 3.1.1 细胞生长与生产力差异

前 40 个迷你池在两种培养基中的批量 assay 结果显示（图 2）：

细胞活力：所有迷你池在 7 天培养中均保持≥85% 的活力（图 2a）。

活细胞密度（VCD）：流加专用培养基中迷你池的平均峰值 VCD（12.2×10⁶活细胞 /mL）显著高于灌注专用培养基（10.5×10⁶活细胞 /mL）（图 2b）。

细胞直径：灌注专用培养基中细胞平均直径（14.5±0.5μm）显著大于流加专用培养基（13.9±0.4μm）（图 2c）。

体积生产力（VolP）：整体迷你池的平均 VolP 在两种培养基中无统计学差异（流加组 166±188μg/mL vs 灌注组 106±134μg/mL），但前 10 个高生产力迷你池的 VolP 存在显著差异（流加组 452±107μg/mL vs 灌注组 307±113μg/mL）（图 2d）。

3.1.2 迷你池排名差异：培养基选择影响筛选结果

两种培养基中迷你池的生产力排名存在显著差异（图 2e）：若基于流加培养基筛选灌注工艺用迷你池，会遗漏 2 个灌注培养基中排名前 5 的迷你池；反之，基于灌注培养基筛选流加工艺用迷你池，也会导致流加培养基中排名第 4、5 的迷你池被排除。这表明，在 CLD 流程早期选择与目标工艺匹配的培养基和 assay 至关重要。

图 2：前 40 个迷你池在两种培养基中的批量 assay 结果（来源：原文 Figure 2）
（a）细胞活力变化；（b）活细胞密度（VCD）变化；（c）细胞直径对比；（d）体积生产力（VolP）对比；（e）迷你池生产力排名对比

3.2 迷你池的流加与半灌注 assay 结果 3.2.1 流加 assay 表现

前 24 个迷你池在流加 assay 中（14 天培养）：

除 1 个迷你池外，其余均保持≥75% 活力；

平均峰值 VCD 为 19.6±3.3×10⁶活细胞 /mL（范围 13.4-25.2×10⁶活细胞 /mL）；

平均峰值 VolP 为 1206±942μg/mL（范围 27-3213μg/mL），前 5 个迷你池（MP36、MP22、MP34、MP27、MP24）的 VolP 均超过 2000μg/mL（图 3a、b）。

3.2.2 半灌注 assay 表现

同一批迷你池在半灌注 assay 中（5 天培养）：

所有迷你池保持≥84% 活力，仅 4 个迷你池活力低于 90%；

平均峰值 VCD 达 46.2±7.8×10⁶活细胞 /mL（范围 28.9-63.2×10⁶活细胞 /mL），显著高于流加 assay，这得益于新鲜培养基的持续补充；

平均峰值 VolP 为 658±561μg/mL（范围 14-1929μg/mL），前 5 个迷你池（MP22、MP34、MP25、MP24、MP36）的 VolP 均超过 1261μg/mL；

平均峰值比生产力（qP）为 11.6±9.8pg・cell⁻¹・day⁻¹（范围 0.3-33.3pg・cell⁻¹・day⁻¹），前 5 个迷你池的 qP 均超过 21.6pg・cell⁻¹・day⁻¹（图 3c、d、e）。

3.2.3 关键发现：筛选指标影响迷你池选择

半灌注 assay 中，基于 VolP 和 qP 的迷你池排名存在差异（图 3f）：若基于流加 assay 的 VolP 选择迷你池（如 MP36、MP22、MP34），会遗漏半灌注 assay 中 qP 最高的迷你池 MP25。这进一步证明，灌注工艺需以 qP 为核心筛选指标，而非仅依赖 VolP。

图 3：前 24 个迷你池在流加 assay 和半灌注 assay 中的表现（来源：原文 Figure 3）
（a）流加 assay 中细胞活力与 VCD 变化；（b）流加 assay 中迷你池 VolP 排名；（c）半灌注 assay 中细胞活力与 VCD 变化；（d）半灌注 assay 中迷你池 VolP 排名；（e）半灌注 assay 中迷你池 qP 排名；（f）两种 assay 中迷你池排名对比

3.3 克隆阶段：灌注培养 CLD 流程开发的克隆性能更优 3.3.1 克隆的流加与半灌注 assay 表现

流加培养组克隆：77 个克隆在 96 深孔板流加 assay 中（7 天培养），除 3 个克隆外均保持≥70% 活力；平均峰值 VCD 为 15.0±6.9×10⁶活细胞 /mL（范围 3.4-32.3×10⁶活细胞 /mL）；平均 VolP 为 722±283μg/mL（范围 180-1408μg/mL），前 15 个克隆的 VolP 均超过 949μg/mL（图 4a、b、c）。

灌注培养组克隆：152 个克隆在 96 深孔板半灌注 assay 中（5 天培养），137 个克隆保持≥70% 活力；平均峰值 VCD 为 40.1±23.2×10⁶活细胞 /mL（范围 2.9-119.4×10⁶活细胞 /mL）；平均 VolP 为 1075.3±594.4μg/mL（范围 26.6-2373.5μg/mL）；平均 qP 为 21.8±10.3pg・cell⁻¹・day⁻¹（范围 5.2-76.9pg・cell⁻¹・day⁻¹），选取 qP≥30pg・cell⁻¹・day⁻¹ 的前 20 个克隆进行后续验证（表 1 为前 20 个克隆的详细性能数据）（图 4d、e、f）。

图 4：两种 CLD 流程开发的克隆在缩小模型中的表现
（a）流加培养组克隆在流加 assay 中的活力分布；（b）流加培养组克隆的 VCD 分布；（c）流加培养组克隆的 VolP 排名；（d）灌注培养组克隆在半灌注 assay 中的活力分布；（e）灌注培养组克隆的 VCD 分布；（f）灌注培养组克隆的 VolP 排名

表 1：灌注培养组克隆在半灌注 assay 中按 qP 排名的前 20 个克隆性能

3.3.2 两种流程克隆在流加培养中的性能对比

选取流加培养 CLD 流程的 11 个最优克隆与灌注培养 CLD 流程的 10 个最优克隆，在 TubeSpin® 生物反应器管中进行流加培养 assay 对比（图 5）：

细胞活力：除各 1 个克隆外，其余克隆均保持≥90% 活力，两组克隆的日均活力无显著差异（图 5a）。

活细胞密度（VCD）：流加培养组克隆的平均峰值 VCD（20.2±4.7×10⁶活细胞 /mL）显著高于灌注培养组（13.8±4.8×10⁶活细胞 /mL），且从培养第 3 天起差异即有统计学意义（图 5b）。

体积生产力（VolP）：两组克隆的平均峰值 VolP 无显著差异（流加组 2822±380μg/mL vs 灌注组 2989±543μg/mL）（图 5c）。

比生产力（qP）：灌注培养组克隆的平均 qP（31.3±11.8pg・cell⁻¹・day⁻¹）显著高于流加培养组（18.7±8.3pg・cell⁻¹・day⁻¹）（图 5d）。

总蛋白产量：尽管 VCD 和 qP 存在差异，但两组克隆的总蛋白产量无显著差异（流加组 84.7±11.4mg vs 灌注组 89.7±15.8mg），表明流加培养组通过 “更多细胞 + 较低单细生产能力” 实现产量，而灌注培养组通过 “较少细胞 + 较高单细生产能力” 达成同等产量。

图 5：两种 CLD 流程克隆在流加培养 assay 中的性能对比（来源：原文 Figure 5）
（a）两组克隆的日均活力；（b）两组克隆的峰值 VCD；（c）两组克隆的峰值 VolP；（d）两组克隆的 qP

3.3.3 两种流程克隆在灌注培养中的性能对比

将上述 21 个克隆在 24 深孔板半灌注 assay 中进一步对比（图 6）：

细胞活力：除各 1 个克隆外，其余克隆均保持≥90% 活力，两组日均活力无显著差异（图 6a）。

活细胞密度（VCD）：流加培养组克隆的平均峰值 VCD（52.3±11.6×10⁶活细胞 /mL）仍显著高于灌注培养组（37.6±7.7×10⁶活细胞 /mL），差异从培养第 3 天起显现（图 6a）。

体积生产力（VolP）：灌注培养组克隆的平均峰值 VolP（1961±74μg/mL）显著高于流加培养组（1777±97μg/mL），差异具有统计学意义（图 6b）。

比生产力（qP）：灌注培养组克隆的平均 qP（44.7±6.6pg・cell⁻¹・day⁻¹）显著高于流加培养组（31.7±8.6pg・cell⁻¹・day⁻¹）（图 6c）。

总蛋白产量：得益于更高的 VolP 和 qP，灌注培养组克隆的总蛋白产量（12.0±0.9mg）较流加培养组（10.4±0.7mg）提升 16%，且差异具有统计学意义（图 6d）。

3.3.4 产物质量与基因稳定性验证

产物质量属性（PQAs）：两组克隆的关键质量属性（糖基化、电荷变异）均在 IgG1 分子的标准范围内，且可通过工艺或培养基调整进一步优化。

基因稳定性：RNA 测序结果显示，两种 CLD 流程开发的克隆在重链和轻链 mRNA 转录本中的突变率无显著差异，表明克隆的序列变异主要源于克隆本身的异质性，而非 CLD 流程。

图 6：两种 CLD 流程克隆在半灌注 assay 中的性能对比（来源：原文 Figure 6）
（a）两组克隆的日均活力与峰值 VCD；（b）两组克隆的日均 VolP；（c）两组克隆的日均 qP；（d）两组克隆的日均产量与总产量

3.4 生物反应器放大验证：灌注培养 CLD 流程优势持续存在 3.4.1 Mobius® breez 微生物反应器验证

将 21 个克隆在 Mobius® breez 微生物反应器中进行动态灌注培养（1VVD 灌注速率），结果与半灌注 assay 趋势一致（图 7）：

细胞活力：流加培养组克隆的平均最低活力（94±4%）与灌注培养组（93±2%）无显著差异，仅 2 个流加培养组克隆的最低活力低于 90%（图 7a）。

活细胞密度（VCD）：流加培养组克隆的平均峰值 VCD（131.4±42.7×10⁶活细胞 /mL）较灌注培养组（96.9±28.2×10⁶活细胞 /mL）高 30%，差异具有统计学意义（图 7b）。

体积生产力（VolP）：灌注培养组克隆的平均峰值 VolP（1489±299μg/mL/day）较流加培养组（1230±125μg/mL/day）高 21%（图 7c）。

比生产力（qP）：灌注培养组克隆的平均峰值 qP（24.8±10.8pg・cell⁻¹・day⁻¹）较流加培养组（15.0±7.4pg・cell⁻¹・day⁻¹）高 65%，差异显著（图 7d）。

图 7：两种 CLD 流程克隆在 Mobius® breez 微生物反应器中的性能对比（来源：原文 Figure 7）
（a）两组克隆的日均活力；（b）两组克隆的峰值 VCD；（c）两组克隆的峰值 VolP；（d）两组克隆的峰值 qP

3.4.2 3L 生物反应器验证

选取两种流程的各 2 个最优克隆在 3L 玻璃生物反应器中验证，结果进一步确认：

流加培养组克隆的峰值 VCD 较灌注培养组高 18%；

灌注培养组克隆的峰值 VolP 和 qP 分别较流加培养组高 21% 和 45%；

两组克隆在通气（sparging）或微通气器（microsparger）激活方面无显著差异，但灌注培养组克隆的最小比气体传输速率（CSPRmin）（11pL・cell⁻¹・day⁻¹）较流加培养组（7.5pL・cell⁻¹・day⁻¹）高 45%，提示灌注培养克隆可能需要更多营养供应。

3.5 克隆稳定性：灌注培养 CLD 流程开发的克隆更稳定

对两种流程的各 8 个克隆进行 20 代传代（约 60 个群体倍增数），通过对比 P0 与 P20 代在半灌注 assay 中的 VCD、VolP、qP 评估稳定性（偏差≤20% 视为稳定，表 2 为克隆排名对比，表 3 为稳定性详细数据）：

体积生产力（VolP）：8 个灌注培养组克隆均保持 VolP 稳定，而流加培养组仅 6 个克隆稳定；

活细胞密度（VCD）：两组均有 50%（4 个）克隆保持 VCD 稳定；

比生产力（qP）：75%（6 个）灌注培养组克隆保持 qP 稳定，而流加培养组仅 1 个克隆稳定；

综合稳定性：仅 1 个流加培养组克隆在 VCD、VolP、qP 三项指标上均稳定，而灌注培养组有 4 个克隆达到全指标稳定。

这表明，灌注培养 CLD 流程开发的克隆不仅在灌注工艺中性能更优，还具备更出色的长期稳定性，更适合商业化生产。

表 2：两种 CLD 流程克隆在半灌注 assay 中的关键指标排名对比

表 3：两种 CLD 流程克隆传代 20 代后的稳定性对比

四、讨论：优化细胞系开发流程的核心价值与未来方向 4.1 灌注培养 CLD 流程的核心优势与机制

本研究明确证实，针对灌注培养工艺设计专属的细胞系开发（CLD）流程，能显著提升细胞系在灌注工艺中的性能，其核心优势源于三个关键设计：

专用培养基：灌注专用培养基（如 EX-CELL® Advanced HD Perfusion Medium）能更好地支持细胞在高营养消耗、高产物收获的灌注环境中生长，避免传统流加培养基导致的 “营养不匹配” 问题；

精准缩小模型：半灌注 assay、Mobius® breez 微生物反应器等缩小模型能更真实地模拟商业化灌注工艺，相比流加缩小模型，可更准确筛选出具备高 qP、适度生长速率的细胞；

多维度筛选标准：不再单一依赖体积生产力（VolP），而是综合评估 VolP、比生产力（qP）、细胞生长速率及参数稳定性，确保筛选出的细胞能在长期灌注过程中持续稳定产率，而非仅在短期流加培养中表现优异。

从机制上看，传统流加培养 CLD 流程本质是 “筛选高细胞密度表型”—— 通过选择能快速增殖、积累大量 biomass 的细胞，实现高 VolP；而灌注培养 CLD 流程则是 “筛选高单胞生产力表型”—— 通过专用培养基和模拟灌注的筛选环境，定向富集具备高效蛋白合成能力（高 qP）的细胞。两种流程的设计差异，直接导致了细胞表型的分化，也解释了为何灌注培养 CLD 流程开发的细胞能在灌注工艺中表现更优。

4.2 研究发现对行业的关键启示 4.2.1 细胞系开发需与目标工艺 “精准匹配”

研究中一个关键发现是：基于流加培养数据筛选的迷你池 / 克隆，可能会遗漏灌注工艺中表现最优的候选者（如半灌注 assay 中 qP 最高的 MP25 迷你池，在流加 assay 中未进入前 5）。这意味着，若继续沿用 “流加 CLD 流程开发细胞→改造用于灌注工艺” 的传统模式，会导致大量优质灌注细胞系被淘汰，不仅降低工艺效率，还会增加研发成本与时间。

因此，行业需建立 “工艺导向的 CLD 流程” 理念：针对流加工艺，可保留传统 CLD 流程；针对灌注等强化工艺，则需采用灌注专用 CLD 流程，从迷你池筛选阶段即引入专用培养基和缩小模型，确保每一步筛选都与最终生产工艺的需求一致。

4.2.2 比生产力（qP）是灌注工艺的核心指标

在灌注培养中，VolP 受细胞密度、培养基交换率等多种因素影响，难以直接反映细胞的真实生产能力；而比生产力（qP） 能消除这些干扰，精准衡量单个细胞的蛋白合成效率，是预测灌注工艺性能的关键指标。研究显示，灌注培养 CLD 流程开发的克隆，qP 较流加培养组高 45%-65%，且这种优势直接转化为 16% 的总蛋白产量提升。

这提示行业在灌注细胞系筛选中，需将 qP 作为核心指标，而非仅关注 VolP。同时，可结合活细胞密度（VCD）、细胞稳定性等参数，建立 “多维度评分体系”，避免因单一指标筛选导致的性能偏差。

4.2.3 缩小模型是 CLD 流程优化的关键工具

研究证实，24 深孔板半灌注 assay、Mobius® breez 微生物反应器等缩小模型，能有效模拟商业化灌注工艺的关键特征（如持续营养供应、产物收获），且成本低、通量高，可在 CLD 早期快速筛选大量候选克隆。例如，通过半灌注 assay 筛选的前 20 个克隆，在 3L 生物反应器中仍能保持性能优势，证明缩小模型的筛选结果具备良好的放大性。

这为行业提供了实用工具：在 CLD 流程中，可通过 “96 孔板静态 assay→24/96 深孔板半灌注 assay→微生物反应器” 的阶梯式缩小模型，逐步缩小候选范围，既能保证筛选精度，又能大幅降低后期大体积生物反应器的实验成本。

4.3 研究局限性与未来优化方向

尽管本研究取得显著成果，但仍存在三个需进一步解决的问题，也为后续研究指明了方向：

4.3.1 灌注细胞系的营养消耗问题

研究发现，灌注培养 CLD 流程开发的克隆，最小比气体传输速率（CSPRmin）较流加培养组高 45%（11pL・cell⁻¹・day⁻¹ vs 7.5pL・cell⁻¹・day⁻¹），表明其对营养（如氧气、葡萄糖）的需求更高。这可能会增加灌注工艺的培养基消耗成本，需通过两种方式优化：

工艺优化：在后续工艺开发中，可通过调整灌注速率（如降低至 0.25VVD 以下）、优化培养基配方（如增加关键营养素浓度），降低单位产物的营养消耗；

CLD 流程优化：在 CLD 筛选阶段，可引入 “低营养环境筛选”—— 如在半灌注 assay 中降低培养基交换率，定向筛选对营养需求较低的细胞，从源头减少营养消耗。

4.3.2 不同规模生物反应器的工艺适配性

研究观察到，在 Mobius® breez 微生物反应器中，灌注培养组克隆的氧消耗率较流加培养组高 22%，但在 3L 玻璃生物反应器中，两组克隆的通气需求无显著差异。这一差异源于两种反应器的氧传递方式不同（微生物反应器通过膜的充放气传氧，3L 反应器通过曝气器传氧），提示不同规模、不同类型的生物反应器，可能会对细胞性能产生不同影响。

未来需进一步研究 “CLD 流程 - 缩小模型 - 生产规模反应器” 的适配性，例如：针对不同类型的生产反应器（如搅拌罐式、波浪式），开发对应的缩小模型；在 CLD 阶段引入多规模反应器验证，确保筛选出的克隆能在商业化生产设备中稳定表现。

4.3.3 CLD 流程的效率提升空间

目前，无论是流加还是灌注 CLD 流程，都需经历 “转染→迷你池筛选→单细胞克隆→克隆验证” 等多个阶段，整个周期通常长达 3-6 个月，且需要大量人工操作。研究中，灌注培养 CLD 流程虽提升了细胞性能，但未缩短研发周期或降低操作负担。

未来可结合人工智能（AI）与机器学习（ML） 技术优化 CLD 流程：例如，通过 AI 分析大量 CLD 数据（如迷你池的 VolP、qP、细胞形态），建立 “预测模型”，在早期阶段即可预测克隆的最终性能，减少后期验证的候选数量；利用自动化液体处理系统，实现 CLD 流程的高通量自动化操作，缩短研发时间。此外，可结合靶向整合技术（如 PiggyBac 转座子系统），提高转染效率与单克隆稳定性，进一步优化 CLD 流程。

4.4 长期价值：推动强化生产工艺的商业化应用

灌注等强化生产工艺的最大优势是能实现连续生产，降低设施成本与产品价格。但长期以来，适配的细胞系缺乏是制约其商业化应用的关键瓶颈。本研究通过优化 CLD 流程，解决了这一核心问题 —— 灌注培养 CLD 流程开发的细胞系，不仅生产力高、稳定性好，还能保持良好的产物质量（糖基化、电荷变异均符合标准），为灌注工艺的大规模应用奠定了基础。

从行业长期发展来看，这种 CLD 流程的优化，有望推动生物制药生产从 “批次生产” 向 “连续生产” 转型：一方面，连续生产可将生产设施规模缩小 50% 以上，大幅降低固定资产投资；另一方面，高生产力、高稳定性的细胞系能减少生产批次间的差异，提高产品质量一致性，降低质量风险。最终，这些进步将转化为更低的药物生产成本，让更多患者能获得可负担的治疗性抗体药物。

五、研究方法详解

为确保研究结果的可重复性，以下对关键实验方法进行补充说明，涵盖细胞培养、 assay 操作、检测方法等核心环节：

5.1 细胞系与培养条件

本研究使用的CHOZN® GS⁻/⁻细胞，购自 MilliporeSigma，其谷氨酰胺合成酶（GS）基因敲除，可通过 GS 筛选系统实现重组质粒的稳定整合。细胞常规培养条件如下：

基础培养基：EX-CELL® CD CHO Fusion（含 6mM L - 谷氨酰胺，流加 CLD 流程）或 Cellvento® 4CHO-X COMP Expansion Medium（无 L - 谷氨酰胺，灌注 CLD 流程）；

培养环境：37°C、5% CO₂、80% 相对湿度；

摇瓶/反应器参数：TubeSpin® 生物反应器管（200 RPM，50mm 轨道振幅，流加培养）或 24 深孔板（320 RPM，25mm 轨道振幅，灌注培养）；

传代频率：每 2-3 天传代一次，接种密度 0.3×10⁶活细胞 /mL。

5.2 转染与迷你池筛选 5.2.1 质粒转染

重组质粒含三个表达盒：GS 基因（筛选标记）、IgG1 重链基因、IgG1 轻链基因。转染步骤如下：

转染前 24 小时，将细胞接种至 0.5×10⁶活细胞 /mL，培养至对数生长期；

离心收集细胞（220×g，5 分钟），重悬于无谷氨酰胺的 EX-CELL® CD CHO Fusion 中，调整密度至 6.25×10⁶细胞 /mL；

将 30μg 质粒（50μL）与 750μL 细胞悬液混合，加入 4mm 电穿孔杯，使用 Gene Pulser XCell 电穿孔仪（Bio-Rad）进行转染，参数为 300V、950μF、无限电阻；

转染后，细胞转移至含 5mL 预热培养基的 T-25 培养瓶，37°C 恢复培养 24 小时。

5.2.2 迷你池 GS 筛选

转染后 24 小时，进行谷氨酰胺缺陷筛选：

离心收集细胞（220×g，5 分钟），去除含谷氨酰胺的培养基；

重悬于 “20% 无谷氨酰胺 EX-CELL® CD CHO Fusion + 80% Cellvento® 4CHO-C Cloning Medium” 混合液中，密度调整至 25,000 细胞 /mL；

以 5000 细胞/孔的密度接种至 96 孔板（200μL / 孔），37°C 培养 3 周，每周补加 25μL 无谷氨酰胺培养基；

当细胞达到 80% 汇合度时，传代至新鲜 96 孔板（无谷氨酰胺培养基），用于后续 7 天静态 assay。

5.3 关键 assay 操作细节 5.3.1 7 天静态 assay

用于迷你池与克隆的初步生产力筛选：

将汇合的 96 孔板细胞传代至新 96 孔板（含 EX-CELL® CD CHO Fusion），静态培养 7 天；

培养结束后，离心（220×g，5 分钟），收集 100μL 上清；

使用 Octet® Qke（Sartorius）检测上清中 IgG1 浓度，计算体积生产力（VolP）。

5.3.2 半灌注 assay（24 深孔板）

模拟灌注工艺的核心筛选步骤：

接种前 3 天，将细胞传代至 0.5×10⁶活细胞 /mL，使用灌注专用培养基（EX-CELL® Advanced HD Perfusion Medium）适应培养；

接种时，调整细胞密度至 1.0×10⁶活细胞 /mL，2mL / 孔接种至 24 深孔板；

培养期间，每日进行 0.5VVD 培养基交换：离心（500×g，5 分钟）收集细胞，去除上清，重悬于新鲜灌注培养基；

培养 5 天，每日取样检测细胞活力（Vi-CELL XR，Beckman-Coulter）、VCD、上清 VolP（Octet® Qke），并计算 qP（qP=VolP/(平均 VCD× 培养时间)）。

5.3.3 Mobius® breez 微生物反应器灌注培养

用于克隆的放大验证：

反应器准备：使用 EX-CELL® Advanced HD Perfusion Medium 校准 pH、溶解氧（DO）传感器，设置参数为 37°C、40% DO、pH 7.00±0.02、5Hz 搅拌频率；

细胞接种：将适应培养后的细胞离心（220×g，5 分钟），重悬于灌注培养基，以 2.0×10⁶活细胞 /mL 的密度接种至反应器；

灌注操作：接种后立即启动灌注，速率为 1VVD（每日交换 1 倍反应器体积的新鲜培养基），同时通过 ATF 系统（交替切向流过滤）移除废培养基与产物；

样品检测：每日取样检测细胞活力、VCD、VolP、qP 及代谢物（葡萄糖、乳酸，BioProfile® FLEX2，Nova Biomedical），持续培养 11 天。

5.4 产物质量与基因稳定性检测方法 5.4.1 糖基化分析

采用 SEC-MS（体积排阻色谱 - 质谱联用）检测 IgG1 重链的糖基化修饰：

蛋白纯化：使用 Protein A 树脂（POROS MabCapture A，ThermoFisher）纯化上清中的 IgG1，洗脱缓冲液为 25mM 柠檬酸（pH 3.0），中和后用于分析；

样品处理：将纯化的 IgG1 用二硫苏糖醇（DTT）还原，分离重链与轻链；

SEC-MS 检测：使用 Waters Acquity UPLC 系统，搭配 Tosoh TSK Gel SW3000XL 色谱柱（300×2.0mm，4μm），流动相为 30% 乙腈 + 0.1% 三氟乙酸，流速 0.07mL/min；质谱采用 Waters Xevo G2S QTOF，检测范围 m/z 400-4000；

数据分析：通过 UNIFI 软件（Waters）对质谱数据进行解卷积，识别重链糖型并计算相对丰度。

5.4.2 电荷变异分析

使用 iCE3 系统（ProteinSimple）进行等电聚焦电泳，检测 IgG1 的电荷变异：

样品制备：将纯化的 IgG1 与 Pharmalyte™两性电解质（pH 5-8、8-10.5）、pI 标记物（7.65、10.1）混合，加入 1% 甲基纤维素；

电泳操作：在 5cm 毛细管中进行 5.5 分钟聚焦，280nm 紫外检测；

数据分析：根据 pI 标记物校准电荷变异峰的 pI 值，将主峰左侧定义为 “酸性变异体”，右侧定义为 “碱性变异体”，通过 Empower 3 软件（Waters）计算各变异体的百分比。

5.4.3 RNA 测序与突变分析

选取 2 个流加培养克隆与 2 个灌注培养克隆，进行 RNA 测序以评估基因稳定性：

RNA 提取：培养第 3 天收集 1×10⁶细胞，使用 Sigma RTN9604 试剂盒提取总 RNA，通过 Agilent 4200 TapeStation 验证 RNA 质量（RIN≥8.0）；

文库构建：采用 Illumina Stranded mRNA Prep 试剂盒构建 mRNA 文库，使用 Illumina RNA UD Indexes Set A 进行索引标记；

测序与分析：在 Illumina NexSeq 2000 平台进行双端测序（56 cycles/端），原始数据通过 STAR 软件比对至 CHO 参考基因组，使用 GATK 软件检测重链、轻链 mRNA 的突变位点，过滤映射质量得分 < 40 的读数，确保突变检测的准确性。