双特异性抗体下游纯化技术全解析：从捕获到杂质控制

摘要：双特异性抗体（bsAb）作为新一代治疗性抗体，能同时结合两个不同靶点，相比传统单克隆抗体具有疗效更强、副作用更低的优势，目前已有14 款获批上市，上百款处于临床前阶段。但因其结构复杂（如 IgG 样与非 IgG 样、对称与不对称设计），下游纯化面临纯度与收率平衡的巨大挑战 —— 既要去除同源二聚体、片段、聚集体等产物相关杂质，也要清除宿主细胞蛋白（HCPs）、病毒、内毒素等工艺相关杂质。本文从双抗纯化的核心步骤出发，系统拆解捕获色谱技术（以亲和色谱为主）、两类杂质的针对性去除策略，结合工艺整合案例，梳理当前技术瓶颈与未来方向，为生物药研发人员提供通俗易懂的技术指南。

一、开篇：认识双特异性抗体 —— 优势显著，纯化却成 “拦路虎”1.1 什么是双特异性抗体？

我们先从 “抗体” 的基本功能说起：传统单克隆抗体只能结合一个靶点，就像 “单任务机器人”；而双特异性抗体（bsAb）是人工合成的 “双任务机器人”，能同时识别并结合两个不同的抗原靶点（比如肿瘤细胞表面的抗原和免疫细胞表面的激活分子），从而实现 “精准靶向 + 协同作用”—— 比如把 T 细胞拉到肿瘤细胞附近，让免疫细胞精准 “击杀” 癌细胞，这种机制让它在癌症、自身免疫病等领域疗效更突出，还能减少对正常细胞的损伤，副作用显著降低。

截至 2024 年，全球已有 14 款双抗获批上市，还有上百款处于不同临床前开发阶段，成为生物药研发的 “热门赛道”。但 “能力越强，结构越复杂”，双抗的纯化难度远大于单克隆抗体，这也是制约其大规模生产的关键瓶颈。

1.2 双抗的结构分类：不同设计，纯化策略大不同

双抗的结构远比单克隆抗体多样，这直接决定了后续纯化方法的选择。根据结构完整性，可分为IgG 样 bsAb和非 IgG 样 bsAb；根据对称性，又可分为对称 bsAb和不对称 bsAb（见图 1）。

IgG 样 bsAb：保留了单克隆抗体的 Fc 结构域，优点是体内稳定性好、半衰期长（能在体内持续发挥作用），但缺点是分子量大，组织穿透性差（比如难以进入实体瘤内部）；

非 IgG 样 bsAb：没有 Fc 结构域，分子小、组织穿透性强，但半衰期短，需要频繁给药；

不对称 bsAb：由 4 条不同的多肽链组成，是目前临床开发的主流，但生产中容易出现 “错配”（比如两条相同的重链结合形成同源二聚体），给纯化带来极大挑战。

1.3 双抗下游纯化的 “标准流程”：6 步清除杂质

双抗的下游纯化是一个 “层层筛选” 的过程，核心目标是：在保证高收率的同时，把所有杂质降到法规要求的水平。标准流程主要包括 6 个步骤（见图 2）：

捕获色谱：第一步 “抓出” 目标双抗，去除大部分杂质；

低 pH 病毒灭活：用酸性条件破坏包膜病毒的结构；

中间纯化：进一步去除产物相关杂质（如同源二聚体）；

精制纯化：精准清除残留的微量杂质；

病毒清除过滤：用专用滤膜截留病毒；

超滤 diafiltration（UF/DF）：浓缩蛋白并更换缓冲液，满足后续制剂要求。

整个过程中，需要重点去除两类杂质：

产物相关杂质：和双抗结构相似的 “同源分子”，如同源二聚体、抗体片段（半抗体、缺轻链片段）、聚集体；

工艺相关杂质：生产过程中引入的 “外来污染物”，如宿主细胞蛋白（HCPs）、病毒、内毒素。

二、核心第一步：捕获色谱 —— 如何高效 “抓出” 目标双抗？

捕获色谱是双抗纯化的 “第一道关卡”，也是最关键的一步 —— 它要从复杂的细胞培养上清中，快速、特异性地捕获目标双抗，同时去除 70% 以上的杂质。目前最主流的技术是亲和色谱（AC），因其特异性强、操作简单，被称为捕获的 “黄金标准”。

2.1 亲和色谱的 “两大阵营”：重链结合 vs 轻链结合

亲和色谱的核心是 “配体 - 抗体” 的特异性结合：配体固定在树脂上，当样品流过时，只有目标双抗会和配体结合，杂质则随流穿液被去除。根据结合的抗体结构区域不同，可分为重链（HC）结合型和轻链（LC）结合型两类树脂（见图 3）。

2.1.1 重链结合型树脂：IgG 样双抗的 “首选”

重链结合型树脂主要结合抗体的重链区域（如 Fc 结构域、CH1 结构域），最常用的是Protein A 亲和色谱。

Protein A 树脂：能特异性结合 IgG 的 Fc 结构域，对 IgG 样双抗的捕获效率极高。比如 Cytiva 公司的 MabSelect SuRe LX 树脂，曾用于捕获不对称 IgG 样双抗，收率达 94.2%，加载量能达到 30g/L—— 这意味着每升树脂能吸附 30 克双抗，适合大规模生产。
为了应对越来越高的细胞培养滴度（CHO 细胞表达的双抗浓度越来越高），新一代 Protein A 树脂如 MabSelect Prism A 也应运而生：它不仅能结合 Fc 结构域，还能结合重链可变区（VH3 结构域），动态结合容量（DBC）达到 58-74mg/ml（2-4 分钟停留时间下），大大提升了生产效率。

Protein G 树脂：也能结合重链，但缺点很明显 ——结合容量低，而且在洗脱步骤（用酸性缓冲液把抗体冲下来）中稳定性差，所以很少用于双抗捕获。

CaptureSelect CH1-LX 树脂：针对 Protein A 需要低 pH（3.6）洗脱的缺点（低 pH 可能导致双抗聚集），这款树脂能结合重链的 CH1 结构域，洗脱 pH 可提高到 4.0—— 更温和的条件能减少双抗变性，提升产品质量。

2.1.2 轻链结合型树脂：非 IgG 样双抗的 “解决方案”

非 IgG 样双抗没有 Fc 结构域，Protein A 树脂无法捕获，这时就需要轻链结合型树脂—— 它们结合抗体的轻链（kappa 链或 lambda 链）区域，比如：

Protein L 树脂：能结合 kappa 轻链的可变区（VL 结构域）；

KappaSelect 树脂：专门结合 kappa 轻链的恒定区（CL 结构域）；

LambdaFabSelect 树脂：专门结合 lambda 轻链的 CL 结构域 。

但这类树脂有个短板：结合容量低，而且洗脱条件更苛刻（比如更高的盐浓度或更低的 pH），所以更多用于 “去除杂质”，而不是直接捕获目标双抗。

2.2 Protein A 的 “替代品”：降低成本，突破瓶颈

虽然 Protein A 是 “黄金标准”，但它有三个致命缺点：树脂价格昂贵（占纯化成本的 30% 以上）、结合容量有限、洗脱条件苛刻（低 pH 易导致双抗聚集）。为了解决这些问题，科研人员开发了三类替代技术：

2.2.1 混合模式色谱（Mix-mode Chromatography）

这类色谱能同时提供多种相互作用（如离子作用、疏水作用），不需要特异性配体，就能捕获双抗。比如 Jerome 等人测试的 PPA HyperCel 树脂，捕获双抗的收率达 93%，同时还能去除 60% 以上的宿主细胞蛋白（HCPs）—— 相当于 “一次操作，两步效果”，减少了纯化步骤。

2.2.2 仿生小肽亲和配体

用人工合成的小肽代替 Protein A 作为配体，优点是稳定性高、洗脱条件温和。比如 Barroedo 等人开发的肽段 Ac-PHQGQHIGVSK，捕获双抗的纯度达 98%，收率 94%，而且成本远低于 Protein A 树脂。

2.2.3 亲和膜色谱（Affinity Membrane Chromatography）

传统的柱色谱是 “树脂颗粒”，而膜色谱是 “多孔膜”，优点是通量高（样品流速快）、周期短。比如 Sartobind® Protein A 膜，用于双抗捕获时，能在保证高纯度的同时，把工艺时间缩短 70%—— 适合需要快速纯化的场景。

不过要注意：这些替代技术目前还没大规模用于工业生产，但未来很可能改变双抗纯化的格局。

三、产物相关杂质去除：精准 “剔除” 同源二聚体、片段和聚集体

产物相关杂质是双抗纯化中最 “难搞” 的一类 —— 它们和目标双抗的 physicochemical properties（ physicochemical properties）相似（比如分子量、电荷），很难通过常规方法分离。主要包括三类：同源二聚体、抗体片段、聚集体（见图 4），下面我们逐一拆解去除策略。

3.1 同源二聚体：双抗 “错配” 的主要产物

不对称双抗由 4 条不同的多肽链组成（两条不同的重链、两条轻链），生产中很容易出现 “错配”—— 比如两条相同的重链结合形成同源二聚体。即使采用 “旋钮入孔（KIH）” 等技术减少错配，同源二聚体仍可能占产品总量的 5%[7]，而它没有双抗活性，必须去除。

3.1.1 亲和色谱：利用 “结合亲和力差异” 分离

亲和色谱去除同源二聚体的核心是：让目标双抗和同源二聚体与配体的结合强度不同，从而在洗脱时分开。常见的有四种策略（见图 5）：

Fc 区域亲和力差异：比如阿斯利康的 DuetMab 平台，把其中一条重链的 Fc 区域改造（称为 Fc），让它无法结合 Protein A。这样一来，Fc-Fc同源二聚体不会结合树脂，随流穿液去除；Fc-Fc 同源二聚体结合力强，需要高浓度洗脱液；而目标双抗（Fc-Fc）结合力中等，能在温和条件下洗脱。Tustian 等人还在洗脱缓冲液中加入 CaCl₂，进一步提升分离效果，最终双抗纯度达 95%。

VH 区域亲和力差异：MabSelect Prism A 树脂能结合 VH3 结构域。如果双抗的两条重链分别是 VH2 和 VH3，那么 VH2-VH2 同源二聚体不结合树脂（流穿去除），VH3-VH3 同源二聚体结合力强（需要低 pH 洗脱），目标双抗（VH2-VH3）则在中间 pH 洗脱 。Chen 等人用这种方法，双抗纯度达 92.2%，收率 90.6%。

CH1 区域亲和力差异：对于 Fab*ScFv 结构的双抗，ScFv-Fc 同源二聚体没有完整的 CH1 结构域，无法结合 CaptureSelect CH1-LX 树脂，而目标双抗能结合，从而分离。

轻链区域亲和力差异：无锡生物的 WuxiBody 平台双抗只有一条 kappa 轻链，而同源二聚体（如 “孔 - 孔” 同源二聚体）的 CH1/CL 区域被 TCR 替代，无法结合 KappaSelect 树脂。Qin 等人用 KappaSelect 树脂 + pH 3.0-3.5 线性梯度洗脱，成功分离出同源二聚体。

3.1.2 离子交换色谱：利用 “电荷差异” 分离

离子交换色谱的核心是等电点（pI）差异：不同蛋白的 pI 不同，在特定 pH 下带电量不同，与树脂的结合力也不同。双抗和同源二聚体的 pI 通常有细微差异，通过调整 pH 或盐梯度，就能分开。

比如 Sharkey 等人用阳离子交换柱 MonoS 10/100 GL，采用 pH 6.5-8.0 的线性梯度（斜率 0.08 pH 单位/CV），成功去除了两种 pI 接近的同源二聚体（pI 分别为 8.95 和 8.36），而用盐梯度（0-1M NaCl）则无法分离—— 这说明 pH 梯度对 pI 接近的杂质分离效果更好。

还有一种 “弱分配模式”：当蛋白的分配系数（Kp）在 0.1-20 之间时，蛋白会短暂结合树脂，而不是完全流穿或紧密结合。Liang 等人用 POROS 50HQ 阴离子交换树脂，在 pH 6.0-6.2、电导率 3.0-4.0 mS/cm 条件下，同源二聚体的去除率达 99%，收率超 60%。

3.1.3 混合模式色谱：“多作用协同” 提升分离效果

混合模式色谱能同时利用电荷、疏水等多种相互作用，分离效果比单纯的离子交换更好。比如 Capto MMC ImpRes 树脂（结合阳离子交换和疏水作用），Tang 等人用 pH 5.5-10.0 的线性梯度，在 pH 7.4 时洗脱出 “孔 - 孔” 同源二聚体，再洗脱目标双抗，最终同源二聚体含量从 10% 降到 1% 以下。

3.2 抗体片段：生产中 “断裂” 的产物

双抗生产中，由于二硫键还原、剪切力等因素，会产生抗体片段，比如只有一个 Fc 结构域的 “半抗体”、缺少一条轻链的 “缺轻链片段”、缺少一个 Fab 臂的 “单臂片段”—— 这些片段没有活性，还可能引发免疫反应，必须去除。

3.2.1 亲和色谱：针对片段的 “结构缺陷” 分离

片段的结构不完整（比如缺少 Fc 或轻链），无法和配体结合，从而被去除：

半抗体：只有一个 Fc 结构域，与 Protein A 的结合力比目标双抗弱。Chen 等人用 Protein A 色谱 + pH 5.5-2.8 梯度洗脱，再加入 500mM NaCl，成功去除了 13% 的半抗体。

缺轻链片段：比目标双抗少一条轻链，无法结合轻链结合型树脂。比如 Wang 等人用 Capto L 树脂（结合 kappa 轻链）+pH 5.0-3.2 梯度洗脱，去除了 82.5% 的缺轻链片段。

单臂片段：缺少一个 Fab 臂，与 VH3 结合配体的亲和力弱。用 MabSelect Prism A 树脂时，在洗脱前加一个 pH 5.5 的洗涤步骤，能去除 46% 的单臂片段；如果用 Fibro Prism A 树脂（纤维素纤维基质，传质更好），单臂片段含量能降到 0.7%。

3.2.2 混合模式色谱：应对高载量下的分离难题

离子交换色谱在高载量（比如 60mg/ml）时，片段去除效率会下降，而混合模式色谱能保持稳定。比如 Zhang 等人对比 POROS 50HQ（阴离子交换）和 Capto Adhere ImpRes（混合模式）：低载量（15mg/ml）时两者效果相当；高载量（60mg/ml）时，Capto Adhere ImpRes 仍能去除 85.9% 的片段，收率 64%—— 更适合大规模生产。

Wan 等人还优化了洗脱模式：用 pH 6.0-8.5+0-250mM NaCl 的 “双梯度”，比单纯的 pH 梯度效果更好，单臂片段去除率 66%，半抗体和缺轻链片段去除率超 95%。

3.3 聚集体：影响安全和收率的 “隐形杀手”

聚集体是双抗分子通过共价或非共价作用形成的 “大分子团”，不仅会降低 Protein A 的结合容量（导致收率下降），还会引发免疫反应（比如产生抗药抗体），必须严格控制。

3.3.1 非共价聚集体：可通过缓冲液调整 “逆转”

非共价聚集体是可逆的，通过调整 pH、离子强度就能转化为单体。比如 Zhang 等人把细胞收获液在 pH 4.0 下孵育 1 小时，再调回 pH 5.5，约 50% 的聚集体转化为单体—— 这一步能大大减少后续纯化压力。

3.3.2 共价聚集体：用色谱方法分离

共价聚集体结构稳定，需要用色谱分离：

亲和色谱：聚集体的结构导致空间位阻大，与配体的结合力比单体弱。Zhang 等人在 Protein A 的洗涤缓冲液中加入 5% PEG 和 500mM CaCl₂，聚集体含量从 20% 降到 3%-4%；Chen 等人在 Protein L 的洗脱缓冲液中加入 100mM Arg-HCl（pH 3.0），聚集体从 66.5% 降到 7.1%。

混合模式色谱：聚集体的表面电荷和疏水性与单体不同，混合模式色谱能利用这些差异分离。比如 Chen 等人用 Capto MMC 树脂，线性梯度洗脱能把聚集体从 20% 降到 0.7%；Zhang 等人用 Diamond MMC Mustang 树脂，纯度从 69.6% 提升到 97.4%。

3.4 产物相关杂质去除策略汇总

为了更清晰地对比不同方法，我们整理了各类产物相关杂质的去除策略（见表 1），包括色谱类型、树脂、双抗形式、去除机制和参考文献。

表 1 双特异性抗体（bsAb）产物相关杂质去除策略汇总

四、工艺相关杂质去除：守住双抗的 “安全底线”

工艺相关杂质是生产过程中引入的外来污染物，主要包括宿主细胞蛋白（HCPs）、病毒、内毒素—— 它们对人体有潜在危害（比如 HCPs 可能引发过敏，病毒可能导致感染），各国法规对其含量有严格限制（如 FDA 要求 HCPs<100ppm ）。下面我们分别介绍去除策略。

4.1 宿主细胞蛋白（HCPs）：最常见的 “工艺污染物”

HCPs 是 CHO 细胞（目前双抗生产的主要细胞）在培养过程中分泌的蛋白质，含量通常很高（可达 10⁵ppm），必须通过多步纯化去除。

4.1.1 亲和色谱：第一道 “筛选”

Protein A 树脂本应特异性结合双抗，但 HCPs 会通过两种方式 “搭便车”：

chromatin（染色质）介导的聚集：染色质同时结合 HCPs 和双抗，形成复合物，一起结合到树脂上；

HCP - 双抗相互作用：部分 HCPs 和双抗有特异性结合，随双抗一起洗脱。

解决方法有两个：

预处理去除染色质：在 Protein A 色谱前加入辛酸沉淀，能减少 2 个对数级（LRV）的 HCPs；

优化洗涤步骤：把洗涤缓冲液 pH 提高到 4.5 以上，再加入盐（如 NaCl）或溶剂，能破坏 HCP - 双抗相互作用，HCP 去除率超 5 个 LRV 。

4.1.2 离子交换色谱：第二道 “把关”

大部分 HCPs 的 pI<7，而双抗的 pI 通常在 7-9 之间。用阴离子交换色谱（如 POROS 50HQ）时，HCPs 带负电，结合树脂；双抗带正电，随流穿液流出 —— 能进一步去除 HCPs。
研究表明：当进料中 HCPs<10²ppm 时，阳离子交换色谱去除率更高（2 LRV）；当 HCPs 在 10³-10⁵ppm 时，阴、阳离子交换效果相当（2-3 LRV）。

4.1.3 深层过滤：去除 “沉淀的 HCPs”

深层过滤由纤维素基质和吸附剂组成，通过尺寸排阻和吸附去除杂质。Protein A 洗脱后，通常会把 pH 调到 5.5（保持双抗稳定），而很多 HCPs 的 pI≈5.5，会在此条件下沉淀 —— 这些沉淀能被深层过滤去除。

4.2 病毒：哺乳动物细胞生产的 “最大风险”

双抗用 CHO 细胞生产，可能引入病毒（如鼠白血病病毒 X-MuLV、细小病毒 MVM）。根据 ICH Q5A 指南，必须建立 “灭活 + 去除” 的双重保障。

4.2.1 低 pH 灭活：针对 “包膜病毒”

包膜病毒（如 X-MuLV）有脂质包膜，低 pH（≤4.0）会破坏包膜，使其失活。Brorson 等人用 pH≤3.8、温度≥14℃的条件孵育 30 分钟，X-MuLV 清除率≥4.6 LRV 。注意：孵育后要及时中和 pH，避免双抗聚集。

4.2.2 色谱去除：针对 “非包膜病毒”

非包膜病毒（如 MVM）没有包膜，低 pH 无法灭活，需要用色谱去除：

Protein A 色谱：对病毒的去除率中等（X-MuLV 2.98 LRV，MVM 2.32 LRV），但在洗涤缓冲液中加入精氨酸或 Triton，能提高去除率 ；

阴离子交换色谱：病毒 pI <双抗 pi，带负电，结合树脂；双抗带正电，流穿 ——x-mulv 去除率 4.22 lrv，mvm 3.25 lrv ；< pan>

混合模式色谱：如 Capto Adhere 树脂，在 pH 6.75、电导率 10 mS/cm 条件下，X-MuLV 去除率 4.5 LRV，MVM 5.8 LRV，效果最好。

4.2.3 病毒过滤：“最后一道屏障”

病毒过滤用孔径约 20nm 的滤膜（如 PVDF、PES 材质），通过尺寸排阻截留病毒（直径 18-26nm），而双抗（直径 12nm）能通过。比如 Pall 公司的 Pegasus™ SV4 滤膜，对细小病毒的去除率达 5.5 LRV。
注意：滤膜的电荷会影响去除效果 —— 当病毒和滤膜电荷相反时，低离子强度下去除率更高；电荷相同时，高离子强度下更好。

4.3 内毒素：革兰氏阴性菌污染的 “信号”

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的成分（脂多糖），会引发发热、休克等反应，必须控制在极低水平（通常 < 0.1 EU/ml）。

内毒素的 pI≈2，在中性条件下带负电，能用阴离子交换色谱去除（如 DEAE 树脂）：内毒素结合树脂，双抗流穿。如果内毒素含量高（>1μg/ml），能减少 5 个数量级；含量低（<10ng/ml）时，需控制进料电导率 < 50mM NaCl，保证内毒素结合。

有时内毒素会和双抗形成复合物（因电荷相反），这时可加入烷二醇破坏复合物，再用离子交换去除。

4.4 工艺相关杂质去除策略汇总

我们整理了工艺相关杂质的去除方法（见表 2），方便大家参考。

表 2 双特异性抗体（bsAb）工艺相关杂质去除策略汇总

五、工艺整合：从 “多步操作” 到 “高效简化”

传统双抗纯化流程（见图 7A）需要 4-5 步色谱（亲和 + 阴离交换 + 阳离子交换），步骤多、周期长、成本高。随着混合模式色谱等技术的发展，工艺整合成为趋势 —— 用 1 步混合模式色谱替代多步离子交换，甚至替代 Protein A，实现 “简化流程、降低成本”。

5.1 混合模式色谱替代离子交换：减少步骤

传统流程中，阴离子交换和阳离子交换需要分别操作，而混合模式色谱（如 Capto MMC）能同时去除同源二聚体、片段、HCPs，可替代这两步（见图 7B）—— 流程从 “亲和→低 pH 灭活→阴离交换→阳离子交换→病毒过滤→UF/DF” 简化为 “亲和→低 pH 灭活→混合模式→病毒过滤→UF/DF”，步骤减少 2 步，周期缩短 30%。

5.2 混合模式色谱替代 Protein A：降低成本

Protein A 树脂成本高，而混合模式色谱（如 PPA HyperCel）能直接从细胞培养上清中捕获双抗，同时去除 HCPs（见图 7C）—— 虽然目前捕获效率还不如 Protein A，但随着技术优化，未来可能成为低成本方案。

六、未来展望：双抗纯化的 “两大突破方向”

随着生物药技术的发展，双抗纯化将向 “更高效、更智能” 方向发展，主要有两个突破点：

6.1 计算机模拟辅助工艺开发

利用深度学习和机制建模，模拟色谱过程中双抗与树脂的相互作用（如电荷、疏水作用），能快速优化工艺参数（如 pH、盐浓度），减少实验次数。比如通过模拟预测不同 pH 下同源二聚体的洗脱位置，能缩短工艺开发时间 50% 以上。

6.2 连续流生产工艺

传统 “批次生产” 需要多次停机、换料，收率低；而连续流生产基于 “数字孪生” 和 “实时监测” 技术，能实现从细胞培养到纯化的 “端到端连续操作”—— 比如用连续亲和色谱替代批次色谱，收率提升 20%，成本降低 15%。目前已有企业尝试将连续流用于双抗生产，未来将成为主流。

七、总结

双特异性抗体作为新一代治疗性抗体，其 “双靶点结合” 的优势让它在临床中前景广阔，但结构复杂导致的纯化难题，是制约其大规模生产的关键。本文从捕获色谱（亲和色谱为主，替代技术潜力大）、产物相关杂质去除（同源二聚体、片段、聚集体的针对性策略）、工艺相关杂质去除（HCPs、病毒、内毒素的法规级控制）、工艺整合（混合模式色谱简化流程）四个维度，系统拆解了双抗下游纯化的核心技术。

未来，随着计算机模拟和连续流技术的应用，双抗纯化将实现 “更高纯度、更高收率、更低成本” 的目标，为更多双抗药物的上市奠定基础，最终惠及患者。

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