狂犬病糖蛋白工程改造：为更高效疫苗开辟新路径

摘要：狂犬病是一种致命性传染病，现有疫苗存在需多剂量接种、成本较高等问题，限制了其在疾病负担较重的低收入地区的可及性。本文聚焦狂犬病病毒糖蛋白（RVG）的结构引导工程改造，通过两种策略探索优化疫苗的可能性：一是对野生型 RVG 的表达cassette进行优化，包括密码子优化、启动子选择、与基质蛋白共表达等；二是通过结构引导的定点突变，增强 RVG 的表达量和融合前构象稳定性。研究发现，部分突变体虽在体外表现出更优的表达和稳定性，但在腺病毒载体和 mRNA 疫苗平台的动物实验中，未显示出比野生型 RVG 更强的免疫原性。不过，这些突变体为蛋白质亚单位疫苗的开发提供了有价值的候选，而全长野生型 RVG 在腺病毒和 mRNA 疫苗中已具备足够的构象稳定性和表达量，可满足小鼠模型中的最佳免疫原性需求。

一、狂犬病疫苗的现状与挑战

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种急性传染病，因其神经嗜性特点，一旦感染中枢神经系统并出现症状，死亡率几乎达 100%。据统计，全球每年约有 55,000 人死于狂犬病，其中 99% 以上的人类感染由犬传播，且病例主要集中在非洲和亚洲的低收入地区。

现有狂犬病疫苗虽能诱导明确的保护性免疫反应，但存在明显局限：

多剂量需求：暴露前预防（PrEP）需 2-3 剂，暴露后预防（PEP）需 3-5 剂，且需结合狂犬病抗体制剂，多次就医对低收入地区患者构成巨大障碍。

成本问题：相对昂贵的价格进一步限制了其在疾病高发地区的普及。

狂犬病病毒糖蛋白（RVG）是诱导保护性中和抗体（VNAs）的关键靶标，也是亚单位疫苗的核心成分。目前，以 RVG 为基础的新型疫苗（如腺病毒载体疫苗、mRNA 疫苗、重组蛋白疫苗等）正处于研发阶段，但尚未解决单剂量保护、长期免疫持续等问题。因此，通过工程改造提升 RVG 的免疫原性，成为开发下一代狂犬病疫苗的核心方向。

二、研究策略：从表达优化到结构改造

为提升 RVG 的免疫原性，研究团队采用了两种互补策略：一是优化野生型 RVG 的表达系统，二是通过结构引导的突变增强其特性。

（一）野生型 RVG 表达 cassette 的优化

该策略旨在不改变 RVG 氨基酸序列的前提下，通过调整表达元件提升其表达量和免疫原性，具体包括以下方向：

启动子比较
评估了三种基于巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子的变体：LPTOS（含内含子 A 和四环素操纵子）、CASI（含 CMV 增强子、鸡 β- 肌动蛋白启动子等）和 Short（不含内含子 A 的 LPTOS 缩短版本）。结果显示，三种启动子驱动的 RVG 表达水平无显著差异（图 1B、C）。

密码子优化
将野生型 ERA 株 RVG 与密码子优化的 PVoG RVG（ Pasteur 病毒株 ectodomain 与 SAD-B19 株病毒内序列的嵌合体）对比，发现 PVoG 在体外表达量显著高于野生型（图 1B、C）。

三聚化结构域插入
在 RVG 的 C 端添加 T4 噬菌体纤维蛋白折叠域（Fib）及不同长度的柔性连接子（Link 或 Longlink），旨在增强其三聚体形成。但结果显示，该改造显著降低了 RVG 的表达（图 1B、C）。

与基质蛋白（RVM）共表达
设计了六种双抗原表达构建体，包括双启动子、内部核糖体进入位点（IRES）连接、自切割 2A 肽（F2A）连接等方式。结果显示，除 F2A 构建体（尤其是 RVM 位于切割肽下游时）表达降低外，其余方式对 RVG 表达无显著影响（图 1B、C）。

图 1，展示了不同表达构建体的结构及体外表达水平

（二）结构引导的 RVG 突变体设计

基于 RVG 的融合前构象对诱导中和抗体的重要性，研究团队设计了 72 种突变体，采用七种策略稳定融合前构象并提升表达（表 1）。

表 1 结构引导的 RVG 融合前构象稳定策略

三、关键发现：体外优化与体内免疫原性的差异（一）野生型 RVG 优化的体内效果

尽管部分构建体在体外表现出更高的表达量（如 PVoG），但在腺病毒载体（ChAdOx2）疫苗的小鼠实验中，所有优化构建体的总抗 RVG IgG 滴度和病毒中和抗体（VNA）滴度均未超过野生型 ERA RVG（图 1E）。这表明，体外表达量的提升并不一定转化为体内免疫原性的增强。

（二）RVG 突变体的体外筛选

通过流式细胞术检测融合前构象特异性抗体 RVC20 的结合情况，评估突变体的表达量（中性 pH 下的中位荧光强度，MFINeut）和酸稳定性（酸性 pH 与中性 pH 的 MFI 比值），发现：

33 种突变体的表达量达到野生型的 70% 以上，其中 V273P-GFP 的表达显著提升（图 3A、C）。

20 种突变体的酸稳定性比野生型高 2 倍以上，H270P 是表现最佳的单突变体（图 3B、D、E）。

未发现同时显著提升表达和稳定性的突变体。

图 3，展示了突变体的表达量和酸稳定性分布

（三）组合突变体的性能

选取 11 种有潜力的单突变体，构建 43 种双突变体和 3 种三突变体，发现：

L271Q+H419L 双突变体的表达量最高（图 5A）。

H270P+H419L 双突变体的酸稳定性最佳（比值 > 0.8），显著高于 H270P 单突变体（比值 0.5）（图 5B、C）。

图 5，展示了双突变体的表达和稳定性优化效果

（四）突变体疫苗的体内免疫原性

在 mRNA 疫苗（脂质纳米粒包裹）的小鼠实验中，H270P 单突变体、H270P+H419L 和 L271Q+H419L 双突变体的总 IgG 滴度、VNA 滴度及 VNA/IgG 比值，均与野生型 PVoG 无显著差异（图 6）。这一结果与此前部分研究中 H270P 突变体增强免疫原性的结论不同，提示免疫原性受疫苗平台、动物模型等多种因素影响。

图 6，展示了不同突变体诱导的抗体反应

四、研究意义与未来方向（一）对疫苗开发的启示

载体疫苗与蛋白质疫苗的差异
全长野生型 RVG 在腺病毒和 mRNA 载体中已具备足够的构象稳定性和表达量，可能无需进一步改造；而突变体在体外的高表达和稳定性，使其更适合蛋白质亚单位疫苗（可提升生产产量和储存稳定性）。

构象与免疫原性的关系
RVG 的融合前构象虽能被部分中和抗体（如 RVC20）识别，但野生型 RVG 在生理条件下可能已主要以融合前构象存在，因此额外的稳定化改造对免疫原性提升有限。

（二）局限性与未来研究

动物模型的局限性：研究仅在小鼠中开展，需在犬等自然宿主中验证。

免疫机制的深入探索：需进一步分析突变体对 T 细胞反应、记忆 B 细胞形成等的影响。

更高表达突变体的筛选：现有突变体的表达提升幅度有限，未来可通过更高效的设计策略优化。

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