Cell | 高度保守的冠状病毒序列被人类T细胞广泛识别

COVID-19 大流行凸显了传统“单病毒-单疫苗”策略在应对高变异、跨物种传播的 Beta 冠状病毒属（Sarbecovirus、Merbecovirus、Embecovirus、Nobecovirus 等）时的脆弱性。该属成员不仅包括 SARS-CoV、MERS-CoV 及 SARS-CoV-2 等已造成重大公共卫生事件的毒株，还涵盖大量具有人畜共患潜力的蝙蝠与中间宿主病毒。中和抗体虽能快速提供保护，但其半衰期短，且对持续进化的受体结合域（Receptor Binding Domain, RBD）突变高度敏感；相反，T 细胞介导的免疫应答主要靶向病毒内部保守表位，展现出跨变异株、跨亚属的交叉识别能力，且在抗体水平显著下降后仍可维持长期保护。然而，迄今尚缺乏系统研究阐明：（1）Beta 冠状病毒属基因组中真正高度保守的功能性片段范围；（2）这些保守序列在人群中的 CD4+/CD8+ T 细胞免疫原性；（3）能否以最小化抗原片段覆盖全球多族群的人类白细胞抗原（Human Leukocyte antigen, HLA）并诱导广谱交叉免疫。

近期，cell杂志发表了题为“Highly conserved Betacoronavirus sequences are broadly recognized by human T cells”的文章。研究整合 Immune Epitope Database (IEDB) 中超2600 条经实验验证的人 T 细胞表位与来自 Bacterial and Viral Bioinformatics Resource Center（BV-BRC）的 125 万余条病毒基因组数据，建立以免疫原性响应频率与跨亚属序列保守度为双阈值的 “保守 T 细胞表位区（CTER）” 筛选框架。通过对 29 名已接种疫苗并发生 SARS-CoV-2 突破性感染的多族裔志愿者进行实验验证，结果表明 Spike-CTER 与 Rest-of-Proteome CTER（包括 N、nsp12、nsp13、ORF3a/7a 等 31 个片段，仅占病毒蛋白组 12%）可显著增强对 OC43、HKU1、MERS-CoV、Bat-SARS-like CoV 及 SARS-CoV 的交叉记忆 T 细胞反应；将 CTER 与全长 Spike 联合后，全球人群 HLA 覆盖率提高约两倍，且去除低覆盖片段后仍可维持高覆盖与免疫原性。该研究为开发“极简-广谱”泛 Beta 冠状病毒 T 细胞疫苗提供了分子基础与人群学依据。

主要内容

1. IEDB 数据强化了 Spike 和 Nucleocapsid 作为CD4+和CD8+的关键靶标

基于 IEDB 全文献挖掘，本研究对 SARS-CoV-2 全抗原组进行系统级免疫原性量化。结果表明：（1）Spike 蛋白以 414 条 CD4+ 和 386 条 CD8+ 表位稳居首位，核衣壳（N）次之（172/141 条），二者共同构成结构蛋白中免疫显性核心（表1）；（2）非结构蛋白 nsp3 在 CD8+ 贡献突出（300 条），而其余结构（M、E）、非结构（nsp4、nsp12、nsp13）及辅助蛋白（ORF3a、7a、8）总计追加 224/524 条表位，提示 T 细胞可广泛识别抗原谱系（表1）；（3）表位-HLA 限制分析覆盖 68 个 Class I 与 85 个 Class II 等位基因，且研究来源在欧美、中国等多地域分布均衡，未见明显人群偏向（图1. A, B）。

综上，IEDB 数据以人群水平再次确认 S 与 N 为 SARS-CoV-2 特异性 CD4+/CD8+ T 细胞应答的免疫优势靶标。

表1.IEDB收录的SARS-CoV-2各蛋白T细胞表位实验数据。

图1.用于CTER设计的表位和病毒序列信息。（A）具有HLA class I 或 class II 限制的IEDB表位数目。（B）IEDB中SARS-CoV-2表位的地理分布。（C, D）蛋白质序列从BV-BRC（https://www.bv-brc.org）下载，使用CD-HIT程序去除过度表示的序列，同时保持序列的多样性，并从每个亚属中选择有代表性的序列作进一步的实验分析。

2. 整合免疫原性和保守性打分定义 CTERs

为了系统评估 SARS-CoV-2 表位在 Beta 冠状病毒属内的保守性，本研究首先针对 GenBank 与 BV-BRC 中 1257887 条基因组存在的极端取样偏倚（Sarbecovirus >1.2 M，Hibecovirus 仅 26 条）进行了降维校正。采用 CD-HIT 聚类（每亚属 20–30 代表株）→ MAFFT 高保真比对 → BLAST 回贴自然序列的策略，最终为每个蛋白抽提 15–138 条病毒株，确保在亚属水平保留最大遗传多样性（图1. C,D）。随后以中位序列一致性为指标，为每条 IEDB 表位计算跨亚属保守得分，并与 ImmunomeBrowser 导出的响应频率（RF）进行整合：CD4+ 区段设定 RF>0.05 且保守度≥67%，CD8+ 区段设定 RF>0.05 且保守度≥80%。交叠上述免疫原-保守片段后，定义出可同时激活 CD4+ 与 CD8+ 记忆 T 细胞的广谱保守 T 细胞表位区（CTERs），为后续疫苗抗原设计提供精简且跨亚属覆盖的分子框架。

3. S-CTERs 始终表现出更高的交叉反应性T细胞反应

在 29 名已接种且经 PCR 确认的 SARS-CoV-2 突破性感染志愿者中，首先用 AIM 试验比较了 Spike-CTER（aa 811–840、901–940、961–1015、1206–1230）与 S-non-CTER 的免疫学特征（图2. A,B）。虽然 S-non-CTER 在 CD4+（p = 0.0002）与 CD8+（p < 0.0001）层面呈现更高的瞬时反应幅度，提示其包含更多免疫显性表位，但交叉反应性评估显示，S-CTER 具有显著优势：针对 Embecovirus (OC43、HKU1)、Nobecovirus (HKU9)、Merbecovirus (MERS) 及 Sarbecovirus (SARS-CoV Tor2) 的代表株，S-CTER 诱导的 CD4+ 反应在 HKU9、MERS、SARS-CoV Tor2 上 fold-change 显著高于 S-non-CTER（p = 0.0191、0.0211、0.0325），CD8+ 反应在 SARS-CoV Tor2 上亦显著升高（p = 0.0024）。综合交叉反应频率（fold-change > 0.33）分析进一步证实，S-CTER 在 CD4+ 与 CD8+ 记忆池中均显著扩大了对多亚属 Beta 冠状病毒的识别广度（p = 0.0312）（图2. C-F）。因此，Spike-CTER 虽非免疫显性最高区域，却是驱动跨病毒 T 细胞交叉记忆的关键保守片段，为泛 Beta 冠状病毒疫苗的精简化设计提供了实验依据。

图2.CD4+ 和CD8+ T 细胞对刺突蛋白 CTER 和 non-CTER 区域的反应。(A, B) 展示 S 蛋白中 CD4+ (A) 与 CD8+ (B) T 细胞的免疫原性和保守度模式：红色曲线（右 y 轴）为响应频率 (RF)，灰色曲线（左 y 轴）为保守度评分。红色虚线表示免疫显性阈值 0.05；灰色点线分别对应 CD4+ 0.67 和 CD8+ 0.80 的保守度阈值。绿色框标注保守 T 细胞表位区 (CTER)。(C, D) CD4+ (C) 与 CD8+ (D) T 细胞应答以倍数变化表示，即各 Beta 冠状病毒代表株相对于祖先型 SARS-CoV-2 S 肽库反应强度的比值（n = 27）。显著性采用 Mann–Whitney 检验（p < 0.05）。(E, F) 展示 CD4+ (E) 与 CD8+ (F) 应答中具有交叉反应（倍数变化 > 0.33）的个体比例，涵盖所测试的各 Beta 冠状病毒物种。

4. 在 RP 中鉴定到其他的保守区域

将 Spike 之外的 SARS-CoV-2 蛋白组纳入分析后，共鉴定 31 个保守 T 细胞表位区（CTER），覆盖 1,326/6,484 aa（20%）；其中 N 蛋白以 340/419 aa（81%）的两大 CTER 占据主导地位，nsp12 与 nsp13 分别贡献 300/932 aa（36%）和 173/601 aa（32%），ORF3a 与 ORF7a 亦分别捕获 58% 与 71% 序列，而 E 蛋白含 47%，M 蛋白无 CTER；整体仅占完整病毒蛋白组 13% 的片段即可定义全部 CTER，为构建极简、跨 Beta 冠状病毒属的 T 细胞疫苗提供了精确抗原谱（图3. A-J）。

图3.（A-J）CD4+ 和 CD8+ T细胞反应映射到SARS-CoV-2蛋白：N (A)；E (B); M (C); nsp3-4 和 12-13 (D-G)；ORF3a、7a、8a （H-J）。

5. 在单个表位水平上，不同冠状病毒亚属的交叉反应性不同

为了在单个表位水平验证交叉反应，作者利用已证实对 SARS-CoV-2 表位 ORF7a90、N134、N311 与 N387 有应答的供者 PBMC 建立短期 T 细胞系（TCL），并对在之前保守性分析序列集中出现频率 ≥2% 的同源肽进行 FluoroSpot IFN-γ 检测（1–0.001 μg/mL 剂量梯度）。结果如图4所示：ORF7a90 的 6 条 Sarbecovirus 同源肽、N134 的 2 条 Embecovirus 同源肽、N311 的 2 条 Merbecovirus+2 条 Sarbecovirus 同源肽，以及 N387 的 1 条 Sarbecovirus+3 条 Merbecovirus 同源肽均可诱导显著交叉反应。该结果提示，单一保守表位的跨亚属覆盖度存在明显差异；而靶向包含多表位的更广区域有望克服这种可变性，从而提升 T 细胞对 Beta 冠状病毒属的广谱交叉潜能。

图4.N-CTER和non-S/N-CTER MPs的交叉反应性反应。(A) IFNγ (SFC/106) FluoroSpot对SARS-CoV-2和同源冠状病毒肽的剂量反应（按亚属颜色编码）。(B)序列同一性、残留变化、总剂量反应性和相对活性汇总表。

6. RP-CTERs增强T细胞跨冠状病毒的交叉反应性

为系统评估 Rest-of-Proteome CTER（RP-CTER）相较于现行全长 Spike（Full S）疫苗的交叉潜力，作者在同一队列 PBMC 中平行检测两类肽库诱导的记忆 T 细胞反应。尽管 RP-CTER 在 CD4+ 与 CD8+ 的瞬时免疫幅度均显著低于 Full S，其在多亚属 Beta 冠状病毒中的交叉反应性却显著优于后者：CD4+ 对 OC43、HKU9、MERS、Bat-SARS 及 SARS-CoV Tor2 的 fold-change 均显著升高（p ≤ 0.0075），CD8+ 在 HKU1、OC43、MERS、Bat-SARS 与 SARS-CoV Tor2 亦呈一致优势（p ≤ 0.0419，图 5A–B）；综合交叉反应频率（fold-change > 0.33）在 CD4+ 与 CD8+ 记忆池中均显著优于 Full S（p = 0.0312，图 5C–D）。N 蛋白与非 S/N-CTER 片段分别贡献不同的交叉模式。Spearman 分析进一步揭示保守度与免疫原性呈正相关，提示高保守区更可能诱导强劲 T 细胞应答。综上，RP-CTER 可通过扩展保守表位识别谱系，显著提升跨 Beta 冠状病毒属的 T 细胞交叉记忆，为下一代极简广谱疫苗设计提供了关键抗原框架。

图5.RP CTERs与Full Spike (S)的交叉反应性比较。（A和B）与祖先的Full S （S-CTER + S-non-CTER）和RP-CTER MPs （n = 27）相比，CD4+ (A) 和 CD8+ (B)反应在乙型冠状病毒中显示出倍增变化。经Mann-Whitney检验，差异有统计学意义（p < 0.05）。（C和D） CD4+ (C) 和 CD8+ (D)反应中出现交叉反应的个体的频率。

7. 将RP-CTERs与完整的S蛋白结合可以提高种群覆盖率

通过 NetMHCpan 系列算法对 15 个地理-族群人群进行 HLA 覆盖预测，结果显示：将全长 Spike（Full S）与 RP-CTER 联合后，CD4+ 与 CD8+ 的潜在 epitope-HLA 组合数均提升 >2 倍（class II 与 class I 均 p < 0.0001），且该优势在全球及各区域累积频率曲线中保持一致（图 6A–D）。在 27 名已 HLA 分型的接种-感染双重暴露志愿者中，联合抗原同样使实际可呈递组合数增加约 2 倍，剔除低覆盖的 Env、nsp12、nsp13 等 CTER 后（RP-CTER-HC），抗原长度压缩至原 CTER 的 18%（全蛋白组 12%），而人群覆盖率与免疫原性未受显著影响（class II p = 0.3761；CD4+ 反应 p = 0.2029；CD8+ 反应 p = 0.3125，图6 E, F）。因此，“Full S + 高覆盖 RP-CTER”策略在保持广谱交叉反应的同时，实现了最小化抗原集与最大化人群覆盖的双重优化，为下一代泛 Beta-CoV 疫苗提供了高效、可扩展的设计框架。

图6. HLA class II 和 class I 对人类HLA人群覆盖率的影响。（A和B）class II (A)和 class I (B)表位- HLA组合人群覆盖率热图；规模，每个组合的平均点击数。右图比较了世界上每个地区蛋白质组合的平均点击率。每个点代表一个不同的区域。Mann-Whitney检验（p < 0.05）。（C和D） II类(C)和I类(D)中识别的表位- hla组合的累积频率曲线，显示了在世界人口中所覆盖的组合比例。（E和F）Full S + RP-CTER与其高覆盖版本Full S + RP-CTER HC（高覆盖）联合治疗CD4+ (E)和CD8+ (F) T细胞应答的比较（n = 27）。

本研究系统整合了 IEDB 的2600余条人T细胞表位与120万条Beta冠状病毒基因组，首次定义仅覆盖SARS-CoV-2全长蛋白13%的31个保守T细胞表位区（CTER）。体外AIM与FluoroSpot实验显示，S-CTER与RP-CTER（含N、nsp12、nsp13、ORF3a/7a等）可在已接种且感染的志愿者PBMC中诱导针对OC43、HKU1、MERS、Bat-SARS及SARS-CoV Tor2的交叉记忆T细胞反应；RP-CTER与全长Spike联合使CD4+/CD8+交叉反应及全球HLA人群覆盖均提升约两倍。进一步剔除低覆盖片段后，抗原长度压缩至全蛋白组的12%，覆盖与免疫原性无显著下降。Spearman分析证实保守度与免疫原性正相关，提示病毒功能必需区更易被T细胞识别。该策略为泛Beta冠状病毒疫苗提供了可直接落地的极简抗原谱，并可扩展至其他高变异病毒家族。

来源 病毒生物信息学

编辑 老Q