Cell | SPIDR：一种高通量检测RBPs与RNA互作的新方法

撰文|存中一贯

RNA结合蛋白（RNA-binding proteins,RBPs）在mRNA的生命周期所有阶段都发挥了重要作用，包括转录、编辑、转运、翻译以及降解【1】。多达30%的人源蛋白质都被认为可以与RNA结合，而RBPs的突变常常与不同的人类疾病密切相关，显示了它们在细胞生理中发挥的重要作用【2】。不过，由于我们对RBPs结合的RNA了解还不多，所以我们仍旧不清楚大部分RBPs所发挥的特殊作用。

另外，人体内有数万种非编码RNA（non-coding RNAs, ncRNAs），这些ncRNA的功能依旧未知，理解它们的功能首先需要鉴定与它们结合的蛋白【3,4】。不过， 限于ncRNAs的庞大数量，而ncRNAs-RBPs的有限配对，现在急需一种高通量的方法对它们进行配对，才能加大对ncRNAs的研究。

2025年7月22日，来自美国哥伦比亚大学 的Marko Jovanovic团队和来自加州理工学院的Mitchell Guttman以及密歇根大学的Jailson Brito Querido团队联合在 Cell 杂志发表了 文章

SPIDR enables multiplexed mapping of RNA-protein interactions and uncovers a mechanism for selective translational suppression upon cell stress

目前，鉴定RBP-RNA相互作用的最常用方法是CLIP（crosslinking and immunoprecipitation followed by sequencing），简单来说，就是利用UV对RNA和其相互作用蛋白进行交联，之后通过免疫共沉淀以及质谱等方法对相关蛋白进行鉴定。但是这种方法只能对某个时间点发生的RBP-RNA相互作用进行鉴定，而利用广泛的基因组学方法进行的探究也只能预测一小部分的RBP-RNA相互作用，且大多局限在一小部分的细胞系中，比如K562和HepG2。然而，RNA和蛋白质的相互作用具有高度的细胞特异性，一种细胞中发现的相互作用在另一种细胞中不一定存在，因此需要高效、高通量的方法以解决这些问题。

研究人员开发了一种新的方法SPIDR以解决上述问题：研究人员首先将不同的抗体与连接寡核苷酸的beads偶联，形成抗体-beads-pools，之后与经过UV交联的细胞裂解液孵育并进行RBP纯化，最后将单个抗体与其作用的RNA通过split-and-pool条形码连接起来。实验过程中，每个beads连接一个特异的寡核苷酸标签以及一个抗体，经过IP后通过测序对RBP结合的RNA进行检测。

为了验证这种方法是否可行和准确，研究人员首先在K562和HEK293T细胞中进行了实验，并对已知的RBPs进行验证。利用这种方法，研究人员检测了下列RNA的真实结合位点，包括SAF-A、PTBP1、SPEN、HNRNPK等，另外，研究人员还进行了重复实验，发现实验结果重复性好。研究人员对于一些RBP进行了检测，发现LSM11与U7 snRNA和端粒酶RNA组分（telomerase RNA component, TERC）结合；与rRNA加工有关的蛋白WDR43能够与45S pre-rRNA以及U3 snoRNA结合；LIN28B同样与45S pre-rRNA结合；还鉴定了NOLC1、DDX52、FUS、SMNDC1、LARP7等一系列RBP的相互作用RNA。

之前有研究显示，一些RBPs能结合其自身基因的mRNAs，比如SPEN/SHARP、UPF1以及DGCR8等，本研究也发现，超过40%的RBPs能够和其自身mRNA结合。

研究人员还对SPIDR产生的结果和ENCODE数据库中由CLIP产生的结果进行了对比，发现两种方法在检测RBP结合的RNA方面具有高度的一致性，这充分证明了此方法在鉴定RBP-RNA相互作用方面具有高度可靠性。由于SPIDR利用的细胞样本是经过UV-crosslinking处理过的，这使得这种方法能够在单核苷酸水平绘制RBP-RNA相互作用图谱。

研究人员还探究了LARP1的相互作用RNA。结果显示，LARP1结合在18S rRNA的1698-1702核苷酸序列，这个区域位于48S结构中，紧挨着mRNA的进入通道。进一步的IP-MS实验显示，LARP1与40S核糖体亚基成分富集。通过冷冻电镜结构，研究人员观察到LARP1结合在40S组分的mRNA通道，与核糖体蛋白uS3，uS5以及eS30直接结合。

总之，本研究设计了一种高通量的RBPs-RNA相互作用鉴定方法SPIDR，能够同时对细胞中的许多RBP的相互作用RNA进行检测和分析，这大大促进了我们对RBPs-RNA相互作用的研究广度和深度，为RBPs以及数量庞大的ncRNA的研究提供了更加便利的工具。

原文链接： https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.06.042

制版人： 十一

参考文献

1. Sonenberg, N., and Hinnebusch, A.G. (2009). Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell 136, 731–745.

2. Caudron-Herger, M., Jansen, R.E., Wassmer, E., and Diederichs, S. (2021). RBP2GO: a comprehensive pan-species database on RNA-binding proteins, their interactions and functions. Nucleic Acids Res. 49, D425–D436.

3. Guttman, M., Amit, I., Garber, M., French, C., Lin, M.F., Feldser, D., Huarte, M., Zuk, O., Carey, B.W., Cassady, J.P., et al. (2009). Chromatin signature reveals over a thousand highly conserved large non-coding RNAs in mammals. Nature 458, 223–227.

4. Statello, L., Guo, C.J., Chen, L.L., and Huarte, M. (2021). Gene regulation by long non-coding RNAs and its biological functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 22, 96–118.

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