Adv Sci丨薛剑煌/史偈君/侯羽君团队合作开发新型DNA修饰测序技术并揭示5hmC在阿尔茨海默病中的独立调控功能

阿尔茨海默病 （ Alzheimer's disease, AD ）是 一种以进行性认知功能障碍和记忆衰退为特征的神经退行性疾病，全球约有 5000 万患者受其困扰。随着人口老龄化加剧， AD 发病率逐年攀升，但现有治疗手段仅能缓解症状，无法阻止疾病进展，其病理机制尚未 被 完全阐明。 AD 的核心病理特征 包括 β - 淀粉样蛋白（ A β ）沉积和 Tau 蛋白过度磷酸化 ， 然而 以 A β /Tau 病理 假说指导 的 大部分的靶向药物 研发与 临床试验 都 以失败告终，反映出现有理论体系在 AD 机制理解和干预策略上 仍存在不足。

表观遗传修饰被发现与 AD 存在密切关联，已有多项研究揭示 DNA 表观遗传修饰在 AD 中发生了显著改变，提示 DNA 修饰可能作为 AD 早期诊断标记物，其相关调控因子或调控通路可能作为 AD 的新型治疗靶点。在哺乳动物中， DNA 修饰的主要形式是 5- 甲基胞嘧啶（ 5mC ），由 DNA 甲基转移酶（ DNMT ）家族蛋白催化产生。此外， 5mC 可被 TET 双加氧酶进一步氧化产生 5- 羟甲基胞嘧啶（ 5hmC ）、 5- 醛基胞嘧啶（ 5fC ）与 5- 羧基胞嘧啶（ 5caC ）。 5fC 或 5caC 在基因组中的丰度极低，因此被认为是 5mC 去甲基化的中间产物。与之相比， 5hmC 的含量较高，尤其在神经细胞中 5hmC 含量可占 5mC 的 20% 以上，可能发挥了独立的表观调控功能。虽然已有部分研究 发现 在 AD 小鼠模型与病人样本中 5mC 或 5hmC 含量发生了显著改变，但由于 组织样本与检测手段的差异， AD 中不同 DNA 修饰的变化 情况 仍 没有 统一定论。此外，目前仍缺乏 AD 中不同 DNA 修饰在单碱基分辨率水平的分布图谱， 一定程度上 影响了后续的调控机制研究。

近日 ，同济大学 生命科学与技术学院薛剑煌课题组联合史偈君课题组 和侯羽君课题组 在 Advanced Science 期刊发表了题为Direct Sequencing of 5‐Methylcytosine and 5‐Hydroxymethylcytosine at Single‐Base Resolution Unravels Their Distinct Roles in Alzheimer's Disease的研究论文，提出了同时独立检测5mC与5hmC的方案，在单碱基分辨率水平系统揭示了5hmC在AD小鼠海马中的动态变化及其独立于5mC的调控功能。

研究人员基于 莱茵衣藻 来源的 CMD1 蛋白 ，发展出全新的 5mC 保护 方案，结合脱氨酶 开发了 CD-seq 测序方法 ， 实现对 5mC 的 准确识别； 再联合 前人开发的 ACE-seq 用于 5hmC 检测 ，从而 避免 传统 利用“全基因组甲基化测序结果与单一修饰测序结果做减法”的 方案 ，极大减少测序误差，实现对不同 DNA 修饰的独立检测。此外，本 研究还构建了 CT-seq 方法， 与 TAB-seq 方法一同 作为 DNA 修饰 5mC 与 5hmC 的另一种正交验证体系。

利用经典 AD 小鼠模型（ 5×FAD ），研究人员首先 应用 质谱技术发现 5hmC 在 AD 小鼠 的海马与小脑中显著降低，而 5mC 在所有组织中都无显著变化。进一步在 AD 小鼠海马中应用 CD-seq 与 ACE-seq 等测序技术同样得到了与质谱检测相同的结果，提示 5hmC 在 海马 中的动态变化可能 与 AD 发生有重要关联 。 从测序结果上看， 5hmC 的含量降低发生在全基因组范围内的不同位点中，而 5mC 含量在不同位点中则存在升高 、 降低 或不变 等不同变化 ， 提示 5hmC 的变化与 5mC 的改变完全独立。 更重要的是，差异 5hmC 位点与差异 5mC 位点的重叠十分有限 ， 表明 5hmC 可以 作为独立 的 表观遗传标记，在 AD 的 病理进程 中可能发挥重要调控作用。

经典的理论认为 5mC 仅在启动子与增强子区域抑制基因转录，在基因体区域的积累则可以稳定并促进基因表达。在这项工作中，研究人员发现 5hmC 在基因组不同区域（启动子或基因体）都与基因表达呈正相关。相反的是， 5mC 在这些区域的积累都与转录抑制有关，这与经典的理论相左，从侧面验证了 5mC 的独立检测的重要性，也提示 5mC 在不同组织以及基因组不同区域的功能可能存在差异。 然而 ， 虽然 5hmC 在 AD 中大幅减少，但其并未直接导致广泛的基因表达变化，提示 5hmC 可能通过调控染色质开放性 、 DNA 损伤 修复 等非转录机制参与 AD 发病 过程 ，为后续 的机制研究 提供 了 全新思路。

总而言之， 本研究不仅 建立 了 5mC/5hmC 的 高精度 的 独立检测技术 ，还 发现了 5hmC 在 AD 小鼠海马基因组中显著降低，可能发挥了独立于 5mC 的表观调控功能 ，强化了 5hmC 及其调控因子 作为 AD 潜在干预靶点的研究基础。

同济大学 生命科学与技术学院 已毕业 硕士 研究生 王子昕、 博士研究生 陈发 迎和 何宝丹 为本文的共同第一作者。同济大学生命科学与技术学院薛剑煌教授、史 偈 君 教授 与 侯羽君教授 为共同通讯作者。

全文链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202507843

制版人：十一

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