PNAS | 华中农业大学Kenichi Tsuda团队揭示基于异分支酸的水杨酸合成途径在十字花目中的起源与进化轨迹

水杨酸（ Salicylic acid, SA）作为关键的植物防御激素，其在模式植物拟南 芥 中的生物合成主要依赖于异分支酸（IC）途径 ， 该途径 由ICS（ Isochorismate Synthase）、EDS5（ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY5）和PBS3（ AvrPphB Susceptible 3）等关键基因协同作用。然而，该途径在植物界中的进化保守性与起源机制尚不明确。

2025年 7 月 17 日， 华中农业大学Kenichi Tsuda团队 在PNAS发表了题为Emergence ofisochorismate-based salicylic acid biosynthesis withinBrassicales的研究性论文 ，通过系统发育、结构生物学和功能重建分析，精准阐明了这一关键免疫代谢途径在十字花目（ Brassicales ）内的演化历程。该研究揭示了 该途径 并非古老保守，而是 起源于 十字花目 （图1） ， 并且在 番木瓜科（ Caricaceae ）分化之后，通过关键组分的 新功能化 （ Neofunctionalization ）和功能强化（enhancement）而形成的。该工作为理解非 成簇 （non- cluster ）代谢通路的协同进化提供了卓越范例，并对关键酶的结构功能创新提出了深刻见解。

图1 十字花目植物的系统发育关系（Edger et al 2018）

拟南 芥 中，定位 在叶绿体内 的 异分支酸合成酶 ICS1 将 分支酸 催化生成 异分支酸，后者由MATE转运蛋白EDS5输出至细胞质，最终在GH3酰基 腺苷化 酶PBS3的催化下，与谷氨酸结合形成IC-9-Glu，进而生成SA。尽管此路径解析已久，但其进化图景存在诸多空白：ICS、EDS5及PBS3的同源基因在植物界广泛存在，它们的功能是保守的，还是经历了谱系特异性的演化？该通路作为一个整体，是在何时、通过何种分子机制形成的？这些是理解植物免疫系统多样性与演化驱动力的核心问题。

图2除番木瓜外，十字花目物种的ICS同源基因在烟草中具有参与SA合成的功能

通过在烟草中重建SA的合成通路， 将携带来自不同植物物种的 ICS 、 EDS5 和 PBS3 的同源基因的农杆菌菌株共同注射烟草叶片 ，然后利用LC-MS/MS检测SA含量。 研究结果表明 ICS 在早期分化的陆生植物中表现出较弱的功能，而在番木瓜分化后的十字花目物种中显著增强 （图2） 。

图3 AtICS1突变体的功能验证

由于十字花目中的某些物种的ICS具有强烈的参与SA合成的能力，而非十字花目物种则不具有参与SA合成的能力，基于此，通过氨基酸序列比对以及利用AlphaFold2对AtICS1的结构进行预测， 发现AtICS1 E366（对于 ICS 活性是 必须的 ） 背后 有一个广泛的盐桥网络 进行支撑，通过对这些组成盐桥网络的 保守氨基酸位点 进行突变 ， 结果显示AtICS1 R135AD346A , AtICS1 R135AR367A , 和AtICS1 R135AD346AR367A 完全丧失了参与SA合成的能力 （ 图 3 ） ， 表明 十字花目中增强的ICS盐桥网络在稳定关键残基催化方面起着至关重要的作用，从而有助于增强 其活性。

图4 除番木瓜外，十字花目物种的EDS5同源基因在烟草中具有参与SA合成的功能

尽管EDS5在早期分化的陆生植物中存在，但是 只有在番木瓜分化后的一些十字花目物种的EDS5才具有参与SA合成的功能 （ 图 4 ） ，基于此，通过氨基酸序列比对以及利用AlphaFold2对AtEDS5蛋白的结构进行预测，结果显示在功能性EDS5的N-lobe和C-lobe有些比较保守的氨基酸位点，将这些氨基酸位点突变成丙氨酸后，结果表明R366和N369对于AtEDS5的功能是必须的 （ 图 5 ） ，并且在其它功能性的EDS5中进行突变，也证实了这两个位点对于EDS5参与SA合成的功能是必须的。

图5 R366和N369对于AtEDS5的功能是必须的

为了进一步证明非十字 花目的 植物物种 中的 EDS5 同源基因 不具有 参与 SA 合成的能力 ，通过对大豆、玉米和水稻的EDS5突变体分析 ，结果 显示大豆的 eds5 突变体仍然可被病原菌诱导产生大量的SA，而玉米和水稻的 eds5 突变体则积累了与野生型相当的基础SA水平 （ 图 6 ） 。

图6 EDS5不参与大豆、玉米和水稻的SA合成

与ICS和EDS5不同，PBS3似乎只在十字花目中出现并且是在番木瓜分化之后，进化出了参与SA合成的能力（ 图7 ）。

图7 除番木瓜外，十字花目物种的PBS3同源基因在烟草中具有参与SA合成的功能

综上，该研究系统地阐明了十字花目中 基于 异 分支酸 的 SA合成通路的进化轨迹，得出 以下核心结论：

1. 尽管 ICS 基因在陆生植物中普遍存在，但是非十字花目物种（例如地钱和大豆）的 ICS 具有微弱的SA合成的能力，而在某些十字花目物种的 ICS 具有强烈参与SA合成的能力，利用AlphaFold2对AtICS1蛋白结构预测，以及对保守氨基酸位点突变分析表明，增强的ICS活性与围绕一个关键催化氨基酸的盐桥网络的强化有关，这可能提高了酶的特异性活性。

2. 尽管 EDS5 基因在陆生植物中普遍存在，在番木瓜分化之后的物种刺 山柑和 醉蝶花中的EDS5具有参与合成SA的能力，而且通过氨基酸比对和AlphaFold2对AtEDS5蛋白结构预测以及氨基酸位点突变分析表明，在具有功能的EDS5的C 端结构域拥有 两个保守的氨基酸位点，并且对于它们的功能是必须的。以上结果表明EDS5的祖先基因在番木瓜分化之后，发生了基因复制事件，并且发生了新功能化，而在EDS5的C 端结构域获得 了关键的氨基酸替换，这可能促进了EDS5的新功能化。并且这两个位点可作为评估EDS5同源蛋白是否具有参与SA合成能力的重要标志。

3. PBS3 的功能可能仅限于在番木瓜谱系分化之后的十字花目物种中。这表明，在番木瓜谱系分化之后的某些十字花目中 ICS 、 EDS5 和 PBS3 同时具有参与SA合成的能力，而 EPS1 似乎伴随着 ICS 、 EDS5 和 PBS3 具备参与SA合成的能力后，在十字花科中进化出来，以加速SA的产生 。

华中农业大学博士后洪坤奇为论文第一作者，Kenichi Tsuda教授为论文通讯作者。已出站博士后 Masahito Nakano ，已毕业硕士生唐颖、何静静，博士研究生康文尚、姜婉清和黄瑞冬等共同参与了此项研究。复旦大学 Motoyuki Hattor i教授，美国明尼苏达大学 Fumiaki Katagiri 教授，德国马普所 Hirofumi Nakagami 教授， 日本国立遗传学研究所Kenji Fukushima 教授，南京农业大学王一鸣教授，以及华中农业大学李霞教授、郭亮教授、谢卡 斌 教授、李博教授和韩晓伟教授等为本研究提供了宝贵意见和大力支持。感谢华中农业大学李国田 教授和东北农业大学武小侠教授为本研究提供的菌株。该研究得到国家自然科学基金、国家重点研发计划等项目资助。

参考文献

Hong K, Tang Y, Jeanguenin L, Kang W, Wang Yongliang, Zuo L, Li P, He J, Jiang W, Huang R, Matsui H, Wang Yiming, Nakagami H, Li B, Li X, Xie K, Fukushima K, Guo L, Han X, Tsuda K*. Emergence of isochorismate -based salicylic acid biosynthesis within Brassicales . PNAS https://doi.org/10.1073/pnas.2506170122

Edger PP, Hall JC, Harkess A, Tang M, Coombs J, Mohammadin S, Schranz ME, Xiong Z, Leebens ‐Mack J, Meyers BC, Sytsma KJ, Koch MA, Al‐Shehbaz IA, Pires JC. Brassicales phylogeny inferred from 72 plastid genes: A reanalysis of the phylogenetic localization of two paleopolyploid events and origin of novel chemical defenses. Am J Bot , 2018, 105: 463–469.

论文链接：

https://doi.org/10.1073/pnas.2506170122