分子克隆新篇章：告别引物设计酶切测序，无缝克隆再出新技术

作为生物相关专业的您，一定对各种克隆技术不陌生吧？分子克隆主要包括以下几个环节：目的基因DNA的获取、表达载体的选择和准备、酶切与连接、转化与筛选、鉴定与测序等，体外实现目的基因在宿主细胞中的大量复制。

传统的载体构建离不开限制性内切酶。在实验过程中，载体质粒提取、酶切是否完全、连接是否成功、序列是否有突变等多种不确定因素都会限制阳性菌落的获得。整个实验过程还耗时耗力，严重影响科研项目的进度。

为了克服限制酶的局限性，克隆技术已经衍生出多种无缝克隆技术。有一种神奇的实验操作，相信大家都听说过吧？

不用酶切！不用连接！甚至“自信”到不用测序，一步操作把基因片段“滴”进任意质粒，25℃一小时即可完成反应。最关键的是这一技术具有“一对多”的独特本领，在构建入门载体后，可根据自己的需要进行多种表达载体的构建，省去各表达载体之间的引物设计操作。

这就是Gateway克隆技术，一种基于λ噬菌体复制的分子克隆技术，由Invitrogen公司（现Thermo Fisher Scientific）开发。它利用λ噬菌体的附着位点（att位点）和重组酶系统实现DNA片段的无缝克隆和转移。

Gateway技术是限制性内切酶克隆的高效替代方案，但是高昂的BP和LR酶价格，让大部分人望而却步。犹记得研究生期间，每次谈到这一技术时，老板都会抱怨，几百微升的酶却要2W左右，用不起啊！

现在，义翘神州基于Gateway技术，在相关酶的制备工艺上获得突破性进展。ClickWay整合酶有望降到“亲民”价格，让你多了一种平替选择。最最重要的是，我们市场调研的前期阶段，为了测试酶产品的稳定性，开放了一定数量的免费试用名额，诚邀大家一起参与！

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ClickWay一步法模块化

ClickWay整合酶的原理与Gateway技术一样，基于位点特异性重组。噬菌体在感染细菌时会发生整合与切割重组反应。在酶的作用下，attP和attB位点间重组，噬菌体整合到细菌基因组上，并形成两个新的重组位点（attL和attR）。在特定的环境下，attL和attR位点也能重组，导致噬菌体从细菌染色体上切除，重新产生attP和attB位点。在体外，ClickWay整合酶识别载体的att位点，将噬菌体与细菌整合的目的基因（GOI）插入到表达载体的序列中。

ClickWay整合酶原理示意图（源自义翘神州讲座课件）

BP反应：构建入门载体

在BP反应中，ClickWay整合酶识别入门载体（Entry Vector）上的attP位点，以及GOI基因片段两端的attB位点，从而发生催化反应，使两个位点之间发生定向重组反应，形成含有目的基因且两端为attL位点的入门载体。

ClickWay BP克隆试剂盒（货号：SBBP01）包含噬菌体整合酶Int和大肠杆菌整合宿主因子IHF。前者是λ噬菌体将自身DNA整合到E.coli所必需的酶，介导attP和attB之间的重组反应。后者在DNA重组和转录调控过程中发挥作用，与Int协同作用，能够发挥整合酶的催化功能。

BP克隆试剂盒使用简单，可以将含有attB位点的PCR产物整合到含有attP位点的通用供体载体上，如Donor Vector、Gateway®使用的pENTR-TOPO载体，获得在目的基因两端具有attL识别位点的标准化入门载体。

入门载体构建方案（源自义翘神州讲座课件）

本试剂盒针对单片段和多片段克隆进行专门设计优化，经高灵敏度核酸酶活性检测试剂盒（Cat:NE001）确认不存在核酸酶污染，实现了产品活性、鲁棒性和稳定性的显著提升。BP克隆试剂盒可在-80℃条件下独立保存12个月而活性不显著降低，在-20℃稳定保存至少6个月而依旧保持高活性。

LR反应：快速稳定重组

LR反应是将入门质粒中的目的基因转移到表达载体的过程，具有方向性。LR反应操作简单，酶与DNA混合后在25℃孵育一小时即可完成反应，真正的“一步法”，并且还可以在BP反应管中直接加入LR整合酶，“一管到底”。LR反应的切割与连接同步进行，不会产生突变，结果“非必要”不测序。

同样，LR试剂盒也非单一的酶，除了含有Int和IHF外，还有切除酶Xis。Xis能够识别并结合在attL和attR位点附近的特定序列，与整合酶协同作用，促进重组反应进行，使噬菌体DNA从大肠杆菌染色体上精确切除。ClickWay LR试剂盒（货号：SBLR01）中，切除酶有助于高效充足，确保目的基因准确的插入到表达载体中。

LR酶的作用原理（源自义翘神州讲座课件）

ClickWay整合酶省时省力省钱，能够实现不同表达载体与报告载体间的基因重组。ClickWay最大的优势在于通用性强，入门质粒可以与多种含不同功能元件的目的载体进行LR反应，构建多种用途的表达载体，便于在不同宿主细胞中进行基因表达，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。

ClickWay无需考虑目的基因和载体上的酶切位点，节省设计引物、酶切、连接反应的时间，在短时间内完成多个基因的重组载体构建。此外，ClickWay还可以与其他克隆技术结合试验，如Topo克隆

多基因整合反应（源自义翘神州讲座课件）

总之，ClickWay整合酶高效稳定的特性，可以用于高通量载体构建、CRISPR文库、多基因共同表达载体构建、多平台系统平行转化、融合蛋白构建、功能基因组学、蛋白质互作等“黄金”应用场景。

义翘神州ClickWay整合酶操作简单，无需PCR，25℃孵育一小时即可完成载体构建。有望助你告别凌晨3点割胶纯化的苦日子，让你找到分子克隆真正的快乐。现在，赶紧行动起来，申请领取免费试用装吧。

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关于义翘神州

北京义翘神州科技股份有限公司（简称：义翘神州）是国内蛋白、抗体研发生产专家，专注于为生命科学研究和创新药物研发领域提供全面、高质量的重组蛋白和抗体等生物试剂及专业、一站式的技术服务。公司总部位于北京，是国家高新技术企业，于2021年8月在深交所创业板上市，股票代码：301047。

义翘神州拥有9,300余种重组蛋白、近15,000余种抗体、超50,000种基因及性能优越的无血清培养基系列产品，建立蛋白表达、抗体开发与制备以及生物分析与检测的一站式技术服务平台。公司始终坚持自主研发，现已成功研发出全长膜蛋白、激酶、磷酸化抗体等高难度试剂以及数款高质量GMP级别细胞因子产品，具备每年自主开发2000种以上重组蛋白和抗体产品的技术能力，已建成全球规模领先的人源细胞表达重组蛋白生物试剂库。