《AFM》中南民族大学秦四勇/黄蓉：分层结构的可注射肽液晶水凝胶！

第一作者：黄蓉、蔡创

通讯作者：秦四勇

通讯单位：中南民族大学

【全文速览】

天然骨骼肌的显著特征在于其高度分层的微结构与有序排列的肌纤维。针对体积性肌肉损失（VML）的治疗，研发能够复制天然肌肉环境分层排列微观结构的组织支架，既充满希望又面临挑战。此外，理想的支架应具备可调节的成分，以实现特定的功能调控。

近期，中南民族大学秦四勇教授团队创新性地制备了一种可注射的自组装肽液晶（LC）水凝胶，其具有分层纤维排列结构，可有效支持骨骼肌再生。为模拟骨骼肌的物理化学功能，将二维碳化钛纳米片Ti3C2Tx MXene作为外源成分引入LC水凝胶，显著增强了水凝胶的机械强度、抗炎活性和电导率。所得的Ti3C2Tx/LC水凝胶能够有效引导成肌细胞有序排列，促进成肌分化与血管生成。与无序排列的非液晶（NLC）水凝胶相比，具有分层结构的排列Ti3C2Tx/LC水凝胶在大鼠VML模型中，能够显著促进新肌肉组织的形成，并推动肌肉功能恢复。本研究为制备有序排列的水凝胶支架提供了一种高效且实用的策略，在肌肉组织工程和再生医学领域展现出巨大的应用潜力。文章第一作者是中南民族大学黄蓉副教授和硕士研究生蔡创。该研究得到国家自然科学基金（52273313，22377152）、武汉知识创新计划-基础研究（2023020201010150）、中南民族大学中央大学基本科研基金（CZQ24008）、湖北省能源高分子材料工程技术研究中心平台项目（PTZ24012）的资助。

图 1、引导肌细胞排列、促进肌肉再生和功能恢复的定向肽液晶水凝胶支架构建示意图

【研究背景】

体积性肌肉损失（VML）多由严重创伤、车祸、肿瘤切除等病理状况引发，当损伤超出身体再生能力时，会导致肌肉萎缩，损害运动功能并降低生活质量。临床常用自体肌肉移植治疗，但受供体肌肉稀缺、宿主排斥反应及再生效率低等限制。肌肉组织工程通过生物材料支架提供结构支持，展现出治疗潜力，但需模拟天然肌肉组织的分层排列纤维结构以引导细胞定向再生。现有VML支架制造技术（如3D打印、静电纺丝等）因工艺复杂、成本高、设备专用性强且无法复制天然肌肉的单向分层微环境，实际应用受限。此外，预制支架在细胞包裹、成分调节及适应不规则缺损形状方面存在不足，亟需开发兼具可注射性、分层排列结构及成分可调性的新型支架。肽类材料凭借生物相容性、结构可设计性、自组装特性及刺激响应性，成为构建理想支架的候选。其可注射水凝胶特性能填充不规则缺损，通过分子设计可形成分层排列的肽液晶纳米纤维结构。本研究旨在设计自组装肽，构建具有层次比对的水凝胶支架，以实现VML修复与肌肉功能恢复。

【图文导读】

1.Ti3C2Tx/LC 水凝胶的建立与表征

仿生 LC水凝胶支架，通过分子自组装模拟天然骨骼肌的微环境特征。基于C15H31-CONH-VE-CONH2短肽的热响应自组装，构建了具有pH依赖性双折射特性的LC水凝胶：在pH 7.4时形成定向排列的纤维结构（LC水凝胶），而在pH 6.8时呈现随机取向（NLC水凝胶）。扫描电镜（SEM）和扫描透射电镜（STEM）证实，LC水凝胶的纤维呈分级排列，形成包含多级纤维束的微观结构；流变学分析显示其具备类固体行为（储能模量G′＞损耗模量G″）。这种结构差异被归因于谷氨酸残基的质子化状态变化，pH 7.4时去质子化增强静电排斥，促进纳米纤维的有序排列。

为赋予支架多功能性，研究引入Ti3C2Tx-MXene纳米材料，构建了Ti3C2Tx/LC杂化水凝胶。掺入后，水凝胶保持各向异性特征（偏光显微镜和激光散射验证），同时机械刚度显著提升（G′值增加），电导率随MXene浓度梯度增强。可注射性实验表明，LC水凝胶具备温度敏感和剪切稀化特性，注射后仍稳定保留双折射结构。功能上，Ti3C2Tx/LC水凝胶通过清除DPPH自由基（效率提升10倍）和降低细胞内活性氧（ROS），有效缓解氧化应激；同时显著下调炎症因子（TNF-α、IL-4等）的mRNA表达，可为成肌细胞增殖和肌源性分化提供支持性微环境，促进VML缺损的功能再生。

图2.LC、NLC、Ti3C2Tx/NLC和Ti3C2Tx/LC水凝胶的表征。(A)水凝胶的构建示意图。（B， C） LC和NLC水凝胶与Ti3C2Tx MXene混合前后的照片和POM图像。（D， E）自组装肽纳米纤维SEM图像和取向分布统计分析。(F)添加Ti3C2Tx MXene前后LC和NLC水凝胶的储存模量G’和损耗模量G”。（G-I）不同水凝胶的激光散射图像、电导率和自由基清除能力分析。

2.Ti3C2Tx /LC 水凝胶对细胞增殖的促进作用及其调控机制

本研究系统验证了Ti3C2Tx/LC水凝胶的生物相容性及促细胞增殖能力。溶血实验和活/死细胞染色证实两种水凝胶均具备高生物相容性。CCK-8测定表明Ti3C2Tx/LC水凝胶中C2C12细胞7天后存活率显著高于Ti3C2Tx/NLC组，EdU掺入实验进一步证实LC水凝胶具备更强的促细胞增殖能力。转录组分析揭示差异表达基因（DEGs）主要富集于细胞周期、PI3K-Akt及MAPK信号通路，其中Ptx3基因上调与增殖正相关，Angpt1基因下调促进成肌细胞增殖。蛋白质印迹证实LC水凝胶通过上调PCNA及磷酸化Akt、p38 MAPK、JNK、ERK1/2等关键信号分子表达，增强PI3K/Akt和MAPK通路活性。研究证明各向异性Ti3C2Tx/LC水凝胶可通过调控关键信号通路协调细胞生长，展现作为仿生支架的优异潜力。

图3.Ti3C2Tx/LC水凝胶促进成肌细胞C2C12增殖的机制。(A)溶血率分析。(B) Ti3C2Tx/NLC和Ti3C2Tx/LC水凝胶对细胞活力的影响。(C) C2C12细胞在Ti3C2Tx/NLC和Ti3C2Tx/LC水凝胶支架中预培养72 h后的EdU染色。(D)基于转录组测序的KEGG通路富集分析。(E)细胞增殖相关差异表达基因热图。(F) mRNA表达水平定量分析。(G) PCNA、Paxillin、p-AKT、p-Erk1/2、p-p38 MAPK、p-JNK蛋白的Western blot图。(H)免疫印迹数据定量分析。

3.Ti3C2Tx /LC 水凝胶对细胞定向排列和迁移的促进作用

Ti3C2Tx/LC水凝胶通过模拟天然骨骼肌的分层排列结构，有效引导细胞定向生长与迁移。实验表明，在LC水凝胶表面培养的C2C12成肌细胞、HUVEC内皮细胞和3T3成纤维细胞均呈现细长形态及显著定向排列（取向角集中于20°范围内），而NLC水凝胶和2D对照组细胞呈随机分布；纯LC水凝胶（无Ti3C2Tx）同样证实结构本身是接触引导的关键因素。定量分析显示LC水凝胶组细胞扩散面积更大、纵横比更高，且12小时内完成动态排列过程。迁移实验进一步揭示，预培养于LC水凝胶的细胞，其2D划痕于36小时完全闭合，且3D transwell迁移细胞数量较对照组提升明显。研究证明该肽液晶水凝胶的分级纤维排列作为地形线索，可主动调控细胞行为，为肌肉组织再生提供仿生微环境支持。

图4.Ti3C2Tx/LC水凝胶对细胞排列和迁移的调控作用。(A) C2C12、HUVEC和3T3细胞在二维表面、Ti3C2Tx/NLC水凝胶、Ti3C2Tx/LC水凝胶中培养后的共聚焦图像，并对细胞方向分布进行统计分析。C2C12细胞取向在(B) -20°—20°范围内，(C)细胞铺展面积，(D)细胞长宽比的比例。(E) C2C12细胞划痕实验结果图像和(F)定量分析。(G) C2C12细胞Transwell实验结果图像和(H)定量分析。

4.Ti3C2Tx /LC 水凝胶支架诱导成肌分化、ECM构建和血管生成

Ti3C2Tx/LC水凝胶对肌肉再生关键过程起调控作用。Western印迹分析显示，与2D培养组及NLC水凝胶组相比，LC水凝胶组中C2C12细胞的肌球蛋白重链（MHC）蛋白，3T3细胞的I型胶原（ECM关键成分）和波形蛋白（细胞骨架标志物），HUVEC的血管标志物CD31（促进血管腔形成）和eNOS（调节血管舒张）均显著上调。RT-qPCR进一步证实，LC水凝胶组MHC和增殖标志物PCNA的mRNA含量最高，而肌肉生长抑制素（负调控肌生长）水平最低。功能上，鬼笔环肽染色显示LC水凝胶促进更密集的F-actin细胞骨架网络形成，增强细胞附着与迁移能力；HUVEC血管生成实验中，LC水凝胶组管数、连接点、网格面积及血管长度等指标显著优于NLC组。肌管形成实验表明，LC水凝胶支架引导C2C12细胞融合为对齐的多核长条肌管，融合指数达17%，显著高于2D及NLC组的随机取向肌管。综上，Ti3C2Tx/LC水凝胶通过协同调控肌源性分化、ECM重塑、血管生成及细胞骨架组织，为肌肉组织协调再生提供了独特的仿生微环境。

图5. Ti3C2Tx/LC水凝胶对细胞外基质构建、血管生成和成肌分化的诱导作用。(A-B) C2C12细胞内MHC、3T3细胞内I型胶原和vimentin、HUVEC细胞内CD31和eNOS蛋白的 Western blotting图像和相对蛋白表达水平分析。(C) C2C12细胞中myostatin、PCNA、MHC mRNA的 RT-qPCR定量分析。(D) C2C12细胞在水凝胶上预培养三天的细胞骨架形态染色图。(E) HUVEC细胞在水凝胶上预培养一天的血管生成图像和(F)定量分析（管、节点、网数、总网面积）。(G)培养七天后水凝胶支架内形成肌管的二维和三维免疫荧光图像及取向分布。 (H)肌管数，(I)长度，(J)肌管融合指数的定量分析。

5.Ti3C2Tx /LC 水凝胶对肌肉组织和功能的修复作用

构建大鼠胫骨前肌（TA）VML模型。14天组织学分析和免疫荧光显示，与未处理VML模型组及Ti3C2Tx/NLC组相比，Ti3C2Tx/LC水凝胶组显著促进肌肉再生（新纤维直径/数量增加）和血管生成（CD31标记密集），同时胶原蛋白沉积最少，肌球蛋白表达更接近健康组织水平，组织再生更有序。此外，内脏器官及体重监测证实了该支架的生物相容性。

随后通过矿场试验和肌电图实验，评估了各向异性Ti3C2Tx/LC水凝胶支架对大鼠胫骨前肌的功能恢复效果。与未处理的VML模型组及Ti3C2Tx/NLC水凝胶组相比，Ti3C2Tx/LC水凝胶组大鼠的行进距离显著增加，活动范围扩展至整个实验区，并频繁探索中心区域。第28天，Ti3C2Tx/LC水凝胶组经电刺激后的骨骼肌张力明显高于其他两组。以上结果表明，具有对齐和分级微观结构的Ti3C2Tx/LC水凝胶支架通过模拟天然骨骼肌的拓扑特征，有效促进了骨骼肌的组织再生及运动功能恢复。

图6. Ti3C2Tx/LC水凝胶支架植入大鼠体积性肌肉损失模型后对骨骼肌组织的修复。(A)大鼠体积性肌肉损失图像。(B) Ti3C2Tx/LC水凝胶介导的体积性肌肉损失修复示意图。(C)第14天 H&E染色图。(D) VML周围肌纤维直径。(E)有核肌纤维数目（新肌纤维）。(F)第14天再生肌肉的Masson染色图。(G)再生肌肉中胶原蛋白覆盖率分析。(H)组织切片中肌球蛋白重链（MHC，红色）、CD31（绿色）和细胞核（DAPI）的免疫荧光染色。(1)缺陷区域附近的毛细管面积。

图7. Ti3C2Tx/LC水凝胶支架植入大鼠体积性肌肉损失模型后对骨骼肌功能的恢复。(A)矿场实验示意图。(B) 第14天实验大鼠的代表性运动轨迹和(C)总运动距离。(D)肌电图实验示意图。(E) 第28天各组代表性肌电图。(F) 第28天再生肌肉组织的收缩能力。

【总结与展望】

这项研究开发了一种结合地形和生化线索的可注射肽LC水凝胶支架，有效地填补肌肉缺陷，引导细胞排列，并促进肌肉再生。通过分子自组装和热诱导排列，不需要持续的外部刺激或引导系统，构建了一个复制天然骨骼肌细胞骨架的分层结构、定向排列的肽水凝胶支架。通过加入Ti3C2Tx MXene，其生物活性进一步增强，可产生ROS清除及抗炎活性，并改善电导率。Ti3C2Tx/LC水凝胶在促进细胞定向排列、增殖和迁移、成肌分化和血管生成方面的显著能力。在大鼠体积性肌肉损失模型中，Ti3C2Tx/LC水凝胶在促进肌纤维形成、血管生成和功能恢复方面优于未对齐的水凝胶，强调了其重现天然肌肉组织微环境的能力。总之，该仿生肽LC水凝胶支架有望成为促进肌肉组织修复和神经元再生的多功能治疗平台。

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202500204

【通讯作者简介】

秦四勇，博士，教授，硕士生导师，主要从事生物医用材料的基础与应用研究。2014年获武汉大学高分子化学与物理博士学位（导师：卓仁禧院士、张先正教授），同年7月进入贵州大学材料与冶金学院工作，次年4月加入中南民族大学化学与材料科学学院。主持国家自然科学基金2项、湖北省面上基金2项及教育部学术创新项目等近10项，参与国家/省部级重点项目多项。以第一/通讯作者在Coord. Chem. Rev., Angew. Chem. Int. Ed., ACS Nano等国际期刊发表论文40余篇，含ESI高被引论文2篇、热点论文1篇，授权中国发明专利6项。曾获教育部武汉大学博士学术新人奖、湖北省优秀博士学位论文、研究生国家奖学金、武汉大学学术创新奖一等奖等荣誉。

黄蓉，博士，副教授，硕士生导师。2014年获得武汉大学有机化学博士学位, 2015年4月加入中南民族大学药学院，致力于新型生物活性分子的创新发现与功能研究，以应对肿瘤、耐药性细菌感染及难治性自身免疫性疾病的临床治疗挑战。主持2项国家自然科学基金，并参与10余项国家级和省部级科研项目。以第一作者或通讯作者身份在Adv. Funct. Mater., J. Control Release, Acta Biomater., Int. J. Biol. Macromol.等国际期刊发表论文30余篇，并授权6项国家发明专利。