动物行为实验指南︱高架十字迷宫分影响因素（两种品系小鼠为例）

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高架十字迷宫（the elevated plus maze，EPM）是评价啮齿类动物焦虑反应的实验方法，相较伤害性刺激所致小鼠焦虑行为检测（如电刺激、噪声刺激、饮食剥夺和暴露在捕食者气味等）该实验具有操作简单的优点能直观反映小鼠的条件应答。EPM实验是由Handley和Mithani在高架Y型迷宫的基础上发展而来的。EPM由开臂（open arms）和闭臂（closed）各两条组成，呈十字形交叉，交叉部分为中央区距地面有一定高度。其原理是，由于面对新事物（开臂）小鼠会产生好奇心去探究，而它们有嗜暗的天性（闭臂），两者之间发生探究与回避的冲突行为，产生焦虑心理。整个迷宫距离地面的高度相当于人类站在悬崖边，易导致动物产生恐惧不安的心理。可以通过比较小鼠在开臂和闭臂内的滞留时间和路程来评价小鼠的焦虑行为。

应用

EPM实验在药物开发和研究中得到广泛的应用主要用于苯二氮卓类药物（benzodiazepine-related compounds）的焦虑抗作用研究，及筛选具有抗焦虑作用的新药，也被用于研究（精神性）药物滥用的影响，及激素的功能，应激对生殖、衰老、妊娠的影响等。抗焦虑药主要选择性地抑制边缘系统的海马、杏仁核，产生抗焦虑作用。

首先实验开始前确认装置是清洁、无味道的（尤其注意上次实验留下的小鼠的粪便等），实验者在操作软件中记录小鼠的编号、日期、状态实验动物提前运送到行为学实验室专用临时笼架，适应环境3h左右，减少动物紧张。

其次将小鼠从笼内取出（小鼠背向实验者），将小鼠放置在开臂与闭臂接合处，小鼠面朝开臂，实验者迅速安静离开EPM，打开录像记录系统，记录小鼠在内的活动，总时间5min实验结束后将小鼠放回笼内。最后：以75%乙醇擦拭实验装置，并用纸巾擦干。

EPM实验是用来检测动物焦虑行为的一个重要实验,可以简单直观地反映其焦虑状态，自发明以来得到了广泛的应用。对于一项以行为学方式检测焦虑的实验，需要具备效度（validity）。效度指的是概念定义（comceptual definition）与操作化定义（opera-tional definition）间是否契合汇。EPM实验具有表面效度（face validaty）、结构效度（construct validity）和预测效度（predictive validity）。表面效度指的是测量的指标能够有效测量实验中想检测的指标（即焦虑）；结构效度指的是测量的指标（如开臂滞留时间等）可以反映无法直接观察的指标（焦虑）；预测效度指的是EPM检测的结果能够预测其他相关实验（比如开场实验）的结果，具有一致性。因为EPM在行为学分析上的效度，在抗焦虑药物的筛选及焦虑行为的检测上得到了广泛的应用。

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注意事项

EPM实验虽然简单，但同样有一些需要注意的步骤。其中最需要注意的是：实验开始时，实验者需要手持小鼠使其背对实验者放置在开臂与闭臂的接合处，且让小鼠面对开臂（若面对闭臂实验结果将受很大影响），且同一实验中所有小鼠均需要面对同一开臂，否则可能会产生数据偏差。接着实验者迅速离开，小鼠进入EPM的同时另一名实验者将记录系统打开,记录小鼠在EPM中的行为。其他一些可能影响EPM实验结果的事项包括小鼠的年龄、性别、营养及健康状态、小鼠对环境的适应、实验条件基本保持一致（实验时间段、固定的实验者、灯光、气味等）。意外情况的处理：在实验中偶尔小鼠会从EPM上掉落，这时实验者需要立即将小鼠从地上抓起放回迷宫并将该事件记录下来，最后在数据处理过程中留意此意外对结果产生的差异。目前，大部分实验是以小鼠四爪都进臂作为完全进臂的标准，也有以动物前爪进入为进臂标准，这与EPM行为分析软件的计算能力有关，本文所用国产软件是将小鼠作为一个整体来分析其在EPM中的表现，软件的处理能力尚待提高。

以C57和129Sv两种小鼠为例说明在焦虑行为分析中的应用。进臂总次数与进入闭臂次数可以整体评价小鼠的活跃程度的标准，实验中发现，C57这两个指标显著小于129Sv小鼠，说明在EPM中小鼠较不活跃。目前，一般认为中央平台区既不属于开臂也不属于闭臂，也有研究者将该区域归为闭臂的延伸，而在一项影响因素分析研究发现中央平台活动时间与小鼠焦虑行为不相关，中央平台区的数据意义存在争议，为了避免平台区的数据干扰，有些研究者改用高架零迷宫（the elevated zero-maze）即开臂与闭臂呈环状联接。开臂和闭臂的数据是EPM实验的重要指标。本实验中两种小鼠之间开臂进入次数占总进臂次数百分比、闭臂进入次数占总进臂次数百分比及开臂滞留时间占总时间百分比均无明显差异。但闭臂滞留时间占总时间百分比C57显著高于129Sv小鼠。综合开臂和闭臂的数据说明小鼠在闭臂停留的时间和进入次数总体上高于129Sv小鼠，两种小鼠在焦虑行为上有差异，C57较129Sv小鼠要更为焦虑。实验条件对行为学实验结果影响较大。有些分析软件可以采集低头（head dips，指小鼠面对开臂时，低头向地板的行为）、后腿直立（rears）及面对刺激的身体伸展姿势（stretch-attend posture，指小鼠在迷宫里虽然不动，但面对刺激时身体会向前或者向刺激方向伸展的行为）的次数和持续时间，而这些因素也被认为是小鼠的“危险评估”（risk assess-ment）行为。

高架十字迷宫实验可以研究小鼠焦虑行为的表型差异，是小鼠行为学研究的重要工具。129Sv和C57小鼠均可成功完成EPM实验，而C57较129Sv更为焦虑。

参考文献

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• 王维刚,吴文婷,周嘉斌,等.小鼠动物实验方法系列专题(五) 应用高架十字迷宫分析小鼠焦虑行为[J].中国细胞生物学学报,2011,33(05):466-472.

• Free versus forced exposure to an elevated plus-maze: evidence for new behavioral interpretations during test and retest[J]. Vincent Roy;;Pierre Chapillon;;Mustapha Jeljeli;;Jean Caston;;Catherine Belzung.Psychopharmacology,2009(1)

• A review of the validity and variability of the Elevated Plus-Maze as an animal model of anxiety[J]. Sandy Hogg.Pharmacology, Biochemistry and Behavior,1996(1)