使用QbD原则确定单克隆抗体的关键质量属性

摘要： 质量源于设计（ Q bD ）是一项全球监管计划，其目标是通过主动设计药品生产流程和控制来促进药物开发，以始终如一地提供产品的预期性能。 ICH 指导文件（ ICHQ8-11 ）中描述了与 QbD 相关的制药开发原则。罗氏 / 基因泰克开发的一套综合风险评估及其相关要素旨在提供重组单克隆抗体生产的产品和工艺知识的概述。本章介绍了关键质量属性（CQA）的鉴定，这是生物制药QbD开发的重要第一步。基于系统、科学的风险排序和过滤方法可以全面了解质量属性，并分配它们对药物安全性和有效性影响的关键性。为了说明该方法和工具的应用，我们展示了一些单克隆抗体的例子。 CQA 的鉴定是一个持续的过程，将进一步推动治疗性蛋白质的结构和功能表征。

（1）介绍

（2）单克隆抗体的关键质量属性：QTPP的定义；质量属性的初步评

（3）质量属性的分类：产品变体和工艺相关杂质；强制性CQA；原材料；可浸出化合物

（4）评估质量属性的重要性

（5）产品生命周期中的关键质量属性(CQA)

（6）CQA识别的示例

（7）学到的教训和未来的机会

（8）总结

1.介绍

关键质量属性（CQA）的鉴定是生物制药开发的重要一步，它取决于对质量属性影响安全性和有效性的可能性的透彻理解。CQA的评估取决于质量目标产品概况（QTPP）定义的预期产品性能的必要产品属性，并考虑其他信息来源（图1）。它与过程特性进一步相关，因为需要评估所有已识别的CQA在制造过程中的可变性，以确定其验收标准和合理的控制策略。

图1.质量源于设计风险评估工具评估产品质量属性的关键性

本章介绍了Roche/Genentech开发的风险排名和筛选方法，用于评估单抗产品的CQA。该方法已在多个开发和许可阶段提交中使用，并且自纳入A-Mab案例研究以来已得到改进。我们的方法考虑了产品属性对生物活性、药代动力学、免疫原性风险和安全性的影响。此外，还对影响严重性评分基础的不确定性进行评估，以确定总体属性严重程度。开发的CQA评估工具为将质量属性声明为非CQA设定了高标准，因为QA的非关键性需要通过该或相关分子的实验和临床数据积极证明，或者只能根据公认的科学文献进行分配。影响范围的截止标准是保守地建立的，如本章中详细描述的那样。

这种风险排名和过滤方法可用于在产品开发的早期识别潜在的CQA，从而在开发期间进行改进，以支持在许可阶段制定适当的控制策略。它需要关注潜在的患者影响，而不考虑过程能力或产品历史，与ICHQ8（R1）中提供的定义一致。

2.单克隆抗体的关键质量属性

质量源于设计ICHQ8（R2）指导文件中将非关键质量属性定义为物理、化学、生物或微生物特性或特性，应在适当的限制、范围或分布范围内，以确保所需的产品质量。此定义仅指潜在的患者影响，这允许我们从评估中删除过程能力。

在传统的药物开发方法中，质量属性被归类为产品相关或工艺相关的物质或杂质，并用于确定将保持临床批次分析特征的特异性（即鉴定、强度和纯度）。交付指定产品的工艺稳健性并不是工艺设计的核心特征。更科学、更系统和更全面的QbD方法旨在识别对产品的安全性和有效性至关重要的产品质量属性，从而将产品质量控制纳入制造过程和药物剂型。下面描述的QbD工具本身提供设计，使产品测试成为一项风险管理活动。这是通过对产品变体、工艺相关杂质、产品成分和强度、外观和微生物属性以及辅料和原材料的关键性进行全面和系统的评估来实现的。

图2.CQA识别工作流程概述

路线图2概述了mAb的CQA最终列表，涉及几个评估步骤，从定义质量目标产品概况（QTPP）开始，该特征列出了提供目标产品概况（TPP）定义的预期产品性能所需的必要产品属性。QTPP和形成中的产品质量属性的其他来源是汇编所有潜在关键质量属性（pCQA）列表的基础。

质量属性可以分为不同的类别。pCQA列表通常包括产品变体和工艺相关杂质，这些杂质可能会影响分子的作用机制/毒性机制（MoAs/MoTs）或一般安全性或药代动力学特性。这两个类别将使用风险排名和过滤方法进行评估，以识别CQA。虽然不能直接研究每种pCQA与临床结果的关系，但可以从分析和生物学特征（包括结构功能研究）推断潜在的患者影响。此外，在产品开发过程中还可以获得特定于产品的一般临床和非临床信息。

使用风险排名和方法评估pCQA的重要性，包括影响生物活性、药理学（PK）/药效学（PD）、免疫原性和安全性。从临床或非临床观察、分析和生物学表征、相关分子的研究、一般（平台）抗体知识和已发表的文献中获得的产品特定信息用于完成此评估。

pCQA的鉴定始于开发早期，并随着对产品的了解越来越深入而发展。pCQA的早期识别有助于将开发工作集中在可能需要更多理解或控制的致敬上。最终的CQA通常在商业流程开发的后期阶段得到确认，以期商业控制策略的最终确定。这种用于识别CQAsin的系统方法需要付出更大的分析努力，但回报在于更深入地了解质量属性的结构-功能关系及其对产品功效和安全性的影响。

2.1.QTPP的定义

生物制药产品（包括mAb）的质量概况由其质量目标产品概况（QTPP）定义，它代表“药品质量特性的前瞻性总结，理想情况下将实现以提供所需的质量，确保药品的安全性和有效性”。QTPP源自预期的产品定位和性能及其关键属性，如正在开发产品的目标产品概况（TPP）中所述。此外，还考虑了内在的药物特性、科学知识和法律要求。表1显示了有关适应症和MoA、剂量和管理、药品要求和产品质量要求的QTPP列表信息示例。分子所需MoA的定义代表了QTPP中的关键内容，因为MoA与CQA评估有关。如果评估中未考虑相关的MoAor不需要的MoT，则得出的CQA列表可能不完整，并最终传播到未检测到的关键过程参数（CPP），而无需适当的工艺表征/验证（PC/PV）研究和不完整的控制策略。

表1：单克隆抗体的QTPP示例

QTPP构成了产品开发的设计基础。它应该在产品的早期开发期间建立，并在产品开发的关键阶段重新审视，即在TPP实施变更后和开始CQA评估之前，任何变更都得到适当治理的批准。

2.2.质量属性的初步评估

需要编制所有潜在关键质量属性（pCQA）的列表（图1）。根据ICH Q8R2，pCQA通过将预期的质量特征与产品的特定属性联系起来，从QTTP衍生而来。例如，如果Fc效应子功能参与MoA，则可能需要将某些Fc糖基化变体视为pCQA。要包含在pCQA列表中，可以在强制降解或特定修饰研究中、在方法表征期间或从制造材料中分离出变体。有关pCQA的其他信息来源包括平台知识和科学文献。需要考虑内在分子特性，例如直接决定抗原结合特性的互补决定性（CDR）。

根据重组蛋白治疗药物的标准预期或药典要求，某些属性被确定为强制性CQA，因为它们对产品安全性和/或有效性以及监管要求具有高度关键性。虽然一些强制性的CQA肯定会由当前的工具来识别，其他CQA反映了卫生当局对某些属性或放行测试的期望。例如，来自细菌或其他微生物的外源因子和污染物在安全性方面至关重要，RFF工具将将其列为CQA。其他因素，例如外观参数，除非可能与安全问题相关，否则CQA评估工具可能不会识别出关键参数，但这些是监管机构的要求。

产品变体和工艺相关杂质代表两个类别，将根据特定产品进行评估，以构建pCQA列表。

3.质量属性的分类

鉴定mAb的pCQA的方法取决于所评估的质量属性（QA）的类别。属性分为以下评估类别：

（1）产品类型

（2）工艺相关杂质

（3）强制性

（4）CQA

（5）原材料和可浸出化合物

将属性划分为这些类别，可以识别特定于产品或工艺的QA与平台mAb工艺常见的QA。

3.1.产品变体和工艺相关杂质

根据产品特定情况评估产品变体和工艺相关杂质的重要性，以考虑独特的修饰、MoAs指示和给药途径。在氨基酸残基或抗原或受体结合位点附近形成的产品变体、聚糖结构和多肽末端的变体可以考虑进行生物活性和PK评估。在评估免疫原性和安全性影响时，需要考虑在所有抗体位点形成的变异。

质量属性可能包括与尺寸相关的变体、电荷相关的变体、氧化相关的变体、糖基化、结构变体和与工艺相关的杂质。表2显示了单克隆抗体的分子变异pCQA的示例列表。可能需要考虑其他分子特异性质量属性。观察到氧化变体主要发生在特定的蛋氨酸和/或色氨酸残基上，而脱酰胺和异构化通常发生在天冬酰胺或天冬氨酸残基上。对于糖工程抗体，其他糖基化变体，如一分为二的N-乙酰葡糖胺（bGlcNAc）或杂化聚糖，可能成为相关的pCQA，以包含在pCQA列表中对于含有Fab糖基化的抗体，需要单独考虑相应的聚糖结构，因为它们的临界性可能与Fc糖基化不同。半胱氨酸形式代表一个质量属性亚组，应评估游离巯基变体以及未释放的二硫键和二硫键修饰，例如三硫化物、硫醚（羊毛硫氨酸）和半胱氨酸化。

表2：单克隆抗体的分子变异pCQA列表

3.2.强制性CQA

由于DS和DP质量属性（如成分和强度、药品外观和不含外源因子）对商品功效或监管要求具有高度关键性，因此默认被归类为强制性CQA。因此，这些CQA未使用本章中描述的风险排名和筛选方法进行评估。分配了最高的关键性影响分数。

3.2.1.组成和强度

以下与DS/DP组成和强度相关的QA被分类为强制性CQAs，因为它们对产品的有效性、稳定性和安全性有影响:

•蛋白质含量

•渗透压

•pH

•外观（颜色、浑浊度、清晰度）

•缓冲液含量

•稀释剂含量

•表面活性剂含量

3.2.2.意外因素控制意外因素以及来自细菌或其他微生物的污染物和杂质也被归类为必需的关键质量属性(CQA)。这些包括：

•病毒

•微生物杂质（细菌，支原体）

•细菌内毒素

3.2.3.药品特定的质量属性液体药品（装在小瓶中）的必要质量属性可能包括：

•亚可见颗粒

•可见颗粒

•可提取体积

•无菌性

对于冻干产品、带有输送设备的组合产品或非给药途径的产品，可能需要考虑其他属性。

3.3.原材料

药物物质制造过程中使用的原材料通过考虑由毒理学家提供的理论估计日摄入量（EDI）与毒理关注阈值（TTC）进行毒性评估。该EDI值是通过将投入过程中的相应原材料的总量相加，然后除以最小产量得出的。这种方法非常保守，因为它没有考虑在引入原材料后后续单元操作中对原材料的去除。获得的值与产品的最大剂量相乘，以得出最终的EDI值。

清除通常通过测试原材料来确定，这些原材料的估计每日摄入量在没有清除的情况下超过TTC。关于清关的处理平台知识可以用于平台单克隆抗体工艺中常用的原材料。

辅料不采用EDI/TTC方法进行评估，因为安全性信息可能通过已上市生物制药产品的经验或通过新产品的临床试验获得。

3.4.可浸出化合物

识别可溶出物作为关键质量属性（CQA）的方法取决于是否能够在最终的药物原料（DS）或药物制剂（DP）中检测到特定的化合物。如果发现特定的可溶出物超过了可接受和安全的水平，例如根据国际会议（ICH）M7的规定，那么该化合物被指定为CQA。

4.评估质量属性的重要性

质量属性（QAs）的关键性评估是一个团队合作的过程，涉及在生物活性、药代动力学（PK）和安全性/免疫原性评估方面具有专业知识的多个技术、临床和非临床职能，以及一名质量保障（QA）代表。卫生当局要求记录建立合理性所需的思考过程，包括产品经验和文献，这些内容最终导致关键性风险评分。

通过风险排名和过滤工具（RRF）评估主要质量属性（pCQAs）的关键性。这使得能够评估每个属性对患者安全和产品有效性的影响。

4.1.风险评估方法的理由

风险评估用于识别关键质量属性（CQA），因为它系统性地指导识别危害以及评估与暴露于这些危害相关的患者安全和产品质量的风险。在ICH指导文件Q9中描述的几种风险评估工具被评估为识别CQA的潜在方法。我们初步的质量通过设计（QbD）工作尝试使用失效模式和影响分析（FMEA）工具来分配CQAs，但这些评估受到工艺能力、稳定性和控制考虑的困扰。

我们策略的一个关键方面是，CQA是有可能影响质量的产品属性，无论制造过程对其控制的能力如何。QA对生物活性和药代动力学（PK）的关键性可能独立于参考标准或临床试验材料中存在的实际水平进行评估，使用非临床模型和分析工具，涵盖更广泛的属性水平。

另一方面，关于安全性和免疫原性的质量属性的关键性评估不能独立于实际存在的水平进行。当影响依赖于临床数据时，我们在评估的一部分中受限于使用处理能力范围内的材料。然而，这些数据是在更广泛的背景下考虑的，考虑到文献和其他抗体产品的经验，并考虑关于变体或杂质的进一步知识和一般关注，以得出在较高水平上是否存在变体或杂质的关注。与聚集体或变体等质量属性的临床经验对于评估免疫原性和安全风险高度相关，但这不应与维护属性关键性和过程能力之间的分离混淆，后者指的是过程在适当水平上保持某些质量属性的能力。

由于可用知识的限制，潜在安全性或免疫原性影响属性的CQA-ACs通常设置得比生物活性或PK影响属性更接近临床经验。

将ICH Q8R2中对关键质量属性（CQA）的定义转化为一项实用工具，以便适用于多种蛋白质，需要明确影响类别和风险评分。设计这个RRF的主要挑战是合理地将实际情况划分为不同类别，以最佳方式反映产品安全性或有效性可能受到影响的风险和担忧水平。使用该工具评估了几个已知的高风险和低风险质量特征示例，以测试分类的评分和结果逻辑。定义了质量属性分类为关键或非关键的整体风险截断水平，采取保守的水平，确保中等到非常高影响评估的结果会被排名为CQA，无论不确定性水平如何。设定的不确定性风险评分确保初看似影响概率低的属性，如果支持该初步结论的数据具有高度不确定性，将被进一步评估为pCQA。

本章提出的方法，包括四个影响参数（生物活性、药代动力学/药效学、免疫原性和安全性）以及不确定性因子，在2008至2009年期间的多个会议上进行了评审，并随后被纳入A-Mab案例研究，作为质量属性评估工具#1。经过一些改进，该方法被用来定义两种单克隆抗体市场申请的关键质量属性（CQA）。

4.2.使用平台知识和/或发表的文献

从文献中得出的QA对生物活性、药代动力学（PK）或安全性和免疫原性的影响通常被赋予高不确定性评分，因为没有该特定分子的可用数据。当明确且明确建立某个变体或杂质不会产生影响时，可以利用文献来评估生物学和PK影响。评估的结果可能导致非关键质量属性（non-CQA）。对于安全性和免疫原性影响的评估，可以使用其他适应症、作用机制、患者群体或给药/剂量的分子的文献，但需要有正当理由。

在单克隆抗体（mAbs）方面，过去三十年来在这些分子的特定变体的形成和相关性方面获得了经验，尤其是在mAbs的保守区域。例如，C端赖氨酸异质性的关键质量属性（CQA）排名可以仅基于外部文献进行，因为有多个来源的证据表明，这种赖氨酸残基在静脉注射给药时在患者体内会被内源性羧肽酶活性迅速去除，因此，它不会像第6.3段所述的那样影响有效性和安全性。因此，可以相当有信心地将C端赖氨酸分类为静脉注射给药的mAbs的非关键属性。文献中报告的特定分子的结构-功能研究在某些情况下可以适用于相关分子的评估，并且可以减少在RRF中反映的不确定性。

针对单克隆抗体产品，关于某些杂质的安全性也获得了更广泛的经验，因为生物制药通常含有来自宿主细胞或工艺的残余杂质水平。然而，是否能将以往生物制药产品的信息和临床经验转移，需要仔细论证，考虑生产过程、暴露水平、作用机制、适应症、给药途径和患者群体。内源性抗体特征文献也将被考虑，以证明内源性抗体和治疗性抗体中存在的属性（如Fc糖基化和脱酰胺化）可能具有的低免疫原性和安全性影响的潜在低风险。

4.3.作用机制：相关生物测定的选择

详细了解不同机制对每种分子体内生物活性的可能贡献，对于选择适当的分析检测策略以测试QAs对生物活性的影响至关重要。除了主要的作用机制（例如，通过受体结合导致的信号干扰），其他机制也可能对整体生物活性做出贡献。对于细胞毒性单克隆抗体，这些机制可能包括但不限于Fc效应功能。不同机制对生物活性的贡献程度因每种分子而异。应根据临床前资料评估不同机制的体内相关性，若有，结合临床数据，以决定在生物活性影响的CQA评估中需考虑哪些机制。同时应考虑内部和已发布的数据。通常无法获得潜在作用机制的临床相关性的直接信息，因此必须评估任何不能被排除的合理机制。对分子的生物活性特征和相关功能域的评估应具有科学依据和严谨性。与提交的监管文件的临床前药理学部分保持一致是至关重要的。

主要的机制作用（MoA）通常通过用于释放和稳定性测试的效力测定来反映。该测定应作为生物活性测定面板的一部分用于关键质量属性（CQA）评估。如果其他机制被认为是相关的，那么CQA风险评估的测定策略取决于相关功能域及其在反映这些机制的测定中比较产品变体的行为。如果一个额外的相关机制依赖于与主要机制相同的功能域，并且相关产品变体在主要机制和额外机制中的活性受到相似的影响，则可以将效力测定作为这两种机制的替代方案。这种方法应当通过相关数据进行适当的证明。

如果在主要机制和额外机制中比较相关产品变体时表现出不同的行为，则应在CQA评估中包含反映额外机制的测定。如果附加机制涉及与主要机制参与的功能域不同的功能域，则应在CQA评估中包含适当的附加测定。对于涉及Fc功能的测定，需要证明其适用性。对这些测定的正式鉴定或验证不被认为是必需的。

生物测定测得的效力是所考虑分子的质量特征，但不被视为CQA本身。效力可被定义为基于与相关生物特性相关的特定质量属性的综合存在及影响的相关生物功能的定量测量。因此，效力的测量可用于确定特征对生物活性的影响的重要性。

4.4.pCQAs的分析和生物特性表征

对于pCQA清单上的某些属性，可以进行分析和生物特征研究，以评估产品变体之间的结构-功能关系以及对生物活性和药代动力学的潜在影响（见图1）。对于这些研究，产品变体需要通过从包含多种变体的产品中分离出来，或者通过施加特定的压力条件或酶处理来生成富集混合物。产品特定的数据相较于基于其他分子或文献的信息的评估，能够以更高的信心评估其关键性。

4.4.1.变异体的生成与分离以进行CQA评估

产品变体可以通过施加特定的应力条件来产生。或者，可能富集在应力条件下的变体可以通过色谱分离从代表性材料中分离出来。糖基化变体可以通过操控细胞培养条件或通过体外修饰获得，并提供对照以进行生物活性测试。

在某些情况下，影响也可能来自开发批次的数据，即在去富含糖的情况下，与ADCC生物活性相关。对于产品变体的实验结构-功能研究，应生成在被研究样本中变体的最高可能水平，而不改变其他变体的水平。基于生物分析或药代动力学数据的关键质量属性（CQA）的关键性排名需要至少50%的富集变体的最低水平。假设一个具有生物活性为<59%或>140%的高影响CQA，该变体必须在混合物中相对丰度至少为50%才能使整体活性发生<80%或>120%的变化（50%+50%x0.59=79.5%），足以使该变体被自信地排名为非CQA。

本章后面的章节（参考第4.5节）将解释特定的排名水平。在某些情况下，变体无法隔离或生成超过50%的水平。在这些情况下，包含一系列值的样本的多次测量可能会允许pCQA水平与功能之间的相关性。将低水平变体的影响推断到高水平的理由必须得到充分合理化，并且必须考虑获得值的检验精度和统计置信度。

4.4.2.同改性和异改性变体

一些蛋白质具有多个相同的亚基，一个或多个多肽链的修饰可能会影响其关键性。标准单克隆抗体由两个重链和两个轻链组成，这些链在氨基酸序列上是相同的。对于双特异性单克隆抗体，两个Fab臂的氨基酸序列及其互补决定区（CDRs）通常不同。根据标准抗体的作用机制，可能只需要结合一个HC/LC臂（单价结合）；在其他情况下则需要两个臂结合（双价结合）。此外，就重链Fc区域的相互作用而言，同源修饰的Fc变体（例如，特定糖形状态修饰过的一个重链）在功能上的影响可能与异源修饰的变体（两个HC都被修饰）有所不同。

在CQA评估研究中，潜在的单价与双价相互作用应考虑与受体结合的关系。例如，已经证明，只有Met252同源氧化变体（两个HC上的Met252残基被氧化）具有降低的PK，表现在曲线下面积（AUC）和FcRn结合的减少。因此，只有同源氧化变体被视为CQA，而异源氧化变体则被归类为非CQA。相反，对于有效的靶向结合和功能，可能需要双价靶向结合，例如曲妥珠单抗的抗增殖活性，其中一个重链的CDR异天冬氨酸修饰足以降低抗增殖作用。去富含岩糖的糖链可能只需要出现在一个重链上以增强ADCC活性，但其他研究表明，即使是异源糖基化的抗体，Fcg效应功能也显著降低。因此，在推测对活性或PK的影响时，必须考虑是否仅需考虑异源修饰变体的含量，还是在双价结合至关重要的情况下同源修饰变体的含量。

如果每个单独的同源二聚体或异源二聚体物种无法直接测量，变异通常是基于肽图分析和二项分布来识别的，在证明独立性的前提下，估计每一项的水平。RRF分别评估如果变体出现在一个位点（异源修饰）或两个位点（同源修饰）时，对对称抗体的潜在影响。

4.4.3.低丰度变体

分析技术的改进，例如质谱技术，已经被证明可以在越来越低的水平上检测和分析分子变体和杂质：低至ppm水平及以下。最近，这导致在生物制药中识别出新的质量属性，例如氧化碳基化和晚期糖基化终产物，通常在非常低的水平。在许多情况下，这些低水平变体可能无法分离或以足够的水平生成以进行CQA评估。此外，许多低水平变体自然发生在患者的内源性蛋白上。因此，这些低丰度变体的评估可能与被认为对自然发生的序列变体相关的分析和水平相一致。导致序列变体的错误翻译频率报告范围为10^5到10^3。考虑到对于一个包含663个氨基酸的单克隆抗体的翻译错误率为10^5，至少会发现一个氨基酸替代物，其水平在0.1%至1%的可检测范围内。因此，考虑到可靠量化序列变体的一般阈值是合理的，这个阈值决定了质量属性是否需要包含在pCQA列表中。然而，针对序列变体，如果结构或计算机分析或先前的数据表明潜在的普遍安全问题或与机制相关的问题（即潜在的低水平拮抗活性），则阈值可能更低。至于序列变体，应该进行选择性样本测试以确认变体仅以非常低的水平稳定存在。

4.4.4.pCQAs定量的检测方法

分子内不同的功能区域需要对关键质量属性（CQA）进行特定站点的评估，以确定一个潜在关键质量属性（pCQA）是否位于或接近影响功能位点。在特定站点识别变异之后，通常使用LCMS肽图谱进行的进一步结构-功能研究可能涉及将相同类型的多个潜在修饰位点汇总为蛋白质中的“兴趣区域”（例如，Fc中的糖基化或蛋氨酸氧化，包括Met252和Met428残基）。对于影响多个位点的此类变异，需要特定背景信息来支持关键性评估。修饰的总水平的测量（而不是基于对效力或药代动力学影响的特定关注位点的水平信息）可能会使关键性评估复杂化。确定框架与CDR或Fc残基的相对反应性可能有助于解释总水平。“区域性检测”更具优势，因为它们通常不那么复杂且劳动密集，允许高通量分析，从而有利于工艺特征化/工艺验证研究。

离子交换高效液相色谱（IE-HPLC）是一种常见的单克隆抗体（mAb）特征化和质量控制方法。这种方法声称可以测量蛋白质的电荷分布，尽管蛋白质与固定相的其他相互作用可能会导致通过非电荷机制的分离。除非对特定变体具有唯一的选择性，否则通常很难达到隔离单个变体所需的基线分离，以便进行具体的CQA评估。色谱图中的区域通常被称为“主峰”、“酸性区域”和“碱性区域”，每个区域包含多种物种。

作为一种实用且相对稳健的方法，IE-HPLC在避免由于样品制备导致的去酰胺化和异构化伪影方面具有一些明显的优势。IE-HPLC的酸性区域已被用作评估PC/PV研究中去酰胺化过程影响的有效替代方法。全面表征酸性区域，以及理解只有常见的酸性变体或额外的新物种的存在，是考虑将IE-HPLC用作酸性变体区域测定的先决条件。IE-HPLC方法缺乏特异性的问题可以通过LC-MS分析来缓解，通过抽查选定的样品以确认酸性区域的一般趋势和极端案例。

4.5.产品变体和过程相关杂质的CQA识别

图1.质量源于设计风险评估工具评估产品质量属性的关键性

在进行分析和生物特性表征后，产品特定的结构-功能关系信息将通过RRF进行分类CQAs（见图1）。此外，临床和非临床观察以及来自相关分子和文献的外部信息将用于评估pCQAs的关键性。

图3.由影响和不确定性定义的风险评分

风险排名方法结合了两个因素：影响和该影响的不确定性（见图3）。影响是一个属性可能对患者安全和产品有效性产生的已知或潜在效果（对安全性和有效性的影响共同构成了00危害00）。不确定性与影响正确分配的相对信心程度有关。影响和不确定性排名具有不同的尺度（影响为2至20，不确定性为1至7），以反映这两个因素的相对重要性，其中影响的权重超过不确定性。为影响和不确定性分配数值并相乘以生成相对风险分数，该分数用于排名。通过设定风险评分的切点作为过滤器，识别出高风险（分类为CQAs）和低风险（分类为非CQAs）的属性。

4.5.1.CQA影响分数和类别

我们需要以一种方式定义诸如“低影响”或“高影响”等一般术语，以便我们的专家团队能够通过调整内部或行业标准，或通过基于专家主导的讨论制定分级患者影响评分来评估每个质量属性的患者风险。这些定义在表3中提供。影响按2到20分的尺度分配，考虑属性对生物活性、药代动力学/药效学、免疫原性和安全性的影响。生物活性和PK评估与证明有效性有关，安全性和免疫原性评估解决安全性问题。

表3：风险排名和筛选工具的影响得分

对产品中个体变异和杂质的评估仅限于那些可以具体评估的变异。通过特定的生成或从产品中分离而富集的变异用于生物活性和药代动力学的影响评估。至于免疫原性和安全性，评估只能涉及药物中变异和杂质的混合物。如果某个变异在产品中的含量达到合理水平，临床经验可能被视为评估的依据。此外，参考文献和其他产品的知识以及变异在体内发生的情况也会被考虑，以判断变异对产品的安全性和免疫原性事件的风险。当变异或杂质以低丰度存在时，并且无法排除其可能带来安全性或免疫原性风险时，会分配高影响和不确定性评分。

4.5.1.1.对生物活性的影响

生物活性可以通过QA的水平与其在最临床相关测定中的效力之间的直接关联来评估。生物活性影响级别包括20%的生物活性变化作为低影响与中等影响之间的边界，这基于一个内部惯例，即商业效力生物测定通常的接受标准至少为±20%宽。中等到高影响的过渡假定为第一个阈值的加倍（从±20%到±40%）。更大的生物活性变化，包括没有生物活性的材料，将具有高影响，而大于100%变化的极高影响类别被添加，因为这种程度的变化需要特别考虑，因其可能导致不想要的毒性。当结构差异无法影响生物活性时，例如C端赖氨酸变异对抗原结合的影响；这些变异对患者的风险较低，相较于可能影响生物活性的变异（如互补决定区域的修饰），其测量效果小于20%。

在相关的效力测定中确定的值会规范化为与压力处理或变异体的丰富/分离一起生成的假治疗对照。未经分级的材料或考虑其相对丰度的重新组合分级可以作为生物活性的100%参考。然而，考虑到没有任何修饰或降解变异的分子作为最相关的参考，如果主要峰值仅包含完全有效的物种，规范化为主要峰值可以被认为是最佳选择。

生物分析方法通常相比于非细胞基础的方法具有更大的变异性。因此，单个结果或生物测定结果集可能没有高统计置信度。为最小化偏差并提高结果的95%置信区间（CIs），从一个分析中确定的单个值计算得出。如果基于初始CIs无法获得具有统计意义的结果，将进行更严格的测试。根据95%CI进行的影响评分分配遵循表3。在置信区间跨越两个CQA排名之间的限制的情况下，将进行较高影响水平的最坏情况排序。

4.5.1.2.对药代动力学和药效学的影响

PK/PD影响考虑了治疗蛋白的清除率，清除率通过对产品浓度-时间图的曲线下面积（AUC）的变化进行测量。对于PK/PD尺度，PK影响尺度的低到中等阈值设定为>20%的差异，这基于2001年FDA的指导原则，该原则允许测试产品的AUC的90%置信区间在参考产品AUC的80%到125%范围内，以证明生物等效性。若AUC变化在20%到40%范围内，且没有药效学（PD）标记物浓度变化（如在利妥昔单抗治疗过程中B细胞耗竭），则影响被认为是中等的，在这种情况下，AUC减少20%不太可能影响由于CD20结合饱和导致的几乎完全的B细胞耗竭。如果PK变化与PD变化相关，例如随着IgE结合的奥马珠单抗抗体，血清PK减少20%可能会导致自由IgE的增加，这可能影响疗效，则影响等级提升为高影响。对于非常高类别，>40%的变化是中等（20%）阈值的两倍。与生物活性一样，无效和低效类别的区别在于对效果的潜在影响。

测量AUC效应的临床或非临床研究很少。对于许多质量属性，包括Fc修饰，FcRn结合可以用作清除的替代指标。SPRFcRn测定被证明对诸如电荷和大小变体以及氧化的蛋氨酸等生物物理参数敏感，反映了已知会改变Fc/FcRn结合和药代动力学的物种。还建立了使用固定FcRn评估相对Fc/FcRn结合的替代模型，当SPR测定中检测到显著差异或对于已知会影响抗体FcRn结合的修饰（例如氧化、去酰胺化）时，可以应用该模型。与SPR测量相比，FcRn亲和层析方法反映了IgG-FcRn相互作用的亲和性，因为固定化的重组人FcRn的量很大。所应用的pH梯度从pH5.5到8.8显示出Fc/FcRn相互作用依赖于渐变的pH变化。这种pH依赖的Fc/FcRn相互作用在生理情况下也是相关的，特别是在Fc/FcRn复合物的内吞体回收过程中。我们认为两种FcRn亲和力方法的相互作用非常适合评估Fc/FcRn相互作用，并且在解决变体的体内药代动力学影响方面是互补的。

其他PK因素包括给药途径、电荷和糖基化。寡甘露糖Fc糖苷（例如Man5）似乎加速了清除。在许多部位进行的化学修饰使抗体变得更碱性，已证明在这些修饰引入超过1个pI单位变化时会增加清除，这是因为更高的代谢率，这些变化远大于通过IEC或IEF解析时酸性、主峰和碱性峰之间的0.1到0.2pI差异。Khawli等人在2010年的研究显示，重组抗体的酸性和碱性形式以与主峰相同的速率被清除，这表明通常存在于单克隆抗体上的电荷变体可以认为对PK影响较小，尽管Fc区域的FcRn结合区的修饰可能需要评估。

4.5.1.3.对免疫原性的影响

免疫原性被定义为治疗药物引发不良免疫反应的潜力。通常通过检测循环中的抗治疗抗体（ATAs，等于抗药物抗体或ADAs）来评估免疫原性。这些免疫原性风险的评估具有挑战性；目前可用的工具（例如，计算机模拟算法）无法预测临床免疫原性，即抗体形成的发生率和抗体的临床后果。

已经开发出体外模型和体外试验，以预测人类对治疗性蛋白质的免疫原性。大多数体外模型侧重于识别蛋白质中的线性T细胞表位，并确定这些表位是否可能被主要组织相容性复合物（HLA）分子呈递。任何已识别的潜在T细胞表位都可以通过其激活体外T细胞的能力得到确认。预测B细胞表位的模型也在开发中。然而，由于大多数B细胞表位是构象型的，因此在评估主要分子的免疫原性方面，其价值有限，因为这些表位难以预测。

目前，这种计算机模型和体外检验对人类免疫原性蛋白治疗的预测能力较低。特定T细胞或B细胞表位的存在与针对某特定表位发展的特异性抗药物抗体（ATA）之间的关系尚不清楚，且尚未在临床上得到验证。此外，目前ATA的发生率和ATA的临床后果无法预测。

免疫原性可能对疗效或安全性没有影响，可能改变药物的药代动力学（PK）和/或药效学（PD），并且可能导致严重的临床不良事件，甚至可能危及生命。在临床研究之前，在评估免疫原性时，可以考虑包含特定变种的相关治疗性单克隆抗体（mAbs）的临床结果，前提是患者人群是相关的。随着产品开发的进行，对特定变种的临床经验逐渐积累。任何产品变种的免疫原性影响的最终评估将基于与ATA发生率和免疫原性相关不良事件（AE）发生率的分子特定临床数据。例如，超敏反应。

免疫原性影响规模是由罗氏/基因泰克的专家工作组开发的，该工作组考虑了抗药性抗体（ADA）对患者的影响；这个ADA风险规模直接转移到表3所示的CQA影响图中。免疫原性影响量表考虑了一个行业组织确定的风险因素。每个质量属性都考虑其引发免疫反应的潜力。由于免疫耐受性，通常认为存在于人类IgG上的属性是无风险或低风险的。一些变体可能引发免疫反应，但不会以类似于同种异型变体的方式影响安全性或有效性，其中Fc氨基酸序列的差异可能产生抗同种异型反应，而不影响临床效用；这些单点变体可能被视为低风险。高风险和非常高风险类别保留给那些其免疫原性可能导致有效性丧失或造成虚弱疾病的属性，例如当重组EPO的抗体同时中和了施用的产品和患者的内源性EPO，从而导致纯红细胞再生障碍症。对于导致对胰岛素或凝血蛋白（例如第八因子）产生ATA反应的杂质，也可能存在类似的高风险或非常高风险属性。

对于在临床材料中存在的变体或杂质，如果没有已建立的与人类受试者免疫原性相关的联系，则免疫原性影响评分可以基于产品的整体临床经验，这与国际会议人用药品注册技术要求（ICH Q6B）指导方针一致，该指导方针指出：“如果证明存在一致的产品异质性模式，则可能不需要对个别形式的活性、有效性和安全性（包括免疫原性）进行评估”。需要注意的是，这种方法将这种类型的分类限制在接近临床研究材料中存在的变体或杂质水平。

4.5.1.4.对安全的影响

安全影响评估表也是由一个专家工作组开发的，该工作组审查了罕见但重要的情况，其中关键质量属性可能导致安全问题。安全评估考虑了结构变异和杂质的潜在体内影响。安全问题源自抗药物抗体（ADA）反应的属性通过免疫原性影响排名进行评估。由于先天免疫反应和非ADA反应（包括抗HCP反应）导致的安全问题属于这一类别。临床材料上存在的属性，如果产品具有良好的临床安全特性，通常被评为低风险。当预计未来水平接近临床暴露时，基于临床经验的评估更具相关性。

强制性的CQA清单包含许多与安全相关的风险，如病毒或其他意外污染物，这些通常不会根据特定产品进行审查。与安全问题相关的CQA的罕见例子包括在某些赛妥昔单抗患者中引发过敏性休克的N-连接Fab寡糖上的Gal（α1-3）Gal表位，以及可能与血清病相关的唾液酸NGNA形式。影响细胞毒性生物活性的QA，例如与全身性细胞因子释放相关的ADCC，也可能对安全产生影响。

不良事件包括输注相关反应（IRR）、注射部位反应、过敏反应、过敏性休克、皮疹、白细胞减少症和血小板减少症。一个可能被评定为中等影响的质量属性的例子是，如果未通过预剂量其他药物（如消炎药或类固醇药物）进行控制，可能导致不良事件的情况，比如输注相关反应，或者可以通过改变给药方案，如将初始或负荷剂量分成两次或多次部分剂量来最小化的情况。可能导致可逆性、不危及生命的不良事件的属性被认为是高影响，例如细菌内毒素。非常高影响类包括那些可能导致危及生命的不良事件的属性，例如上述提到的Gal(alpha1-3)Gal-糖苷，以及那些导致不可逆后果的属性。

4.5.2.不确定性评分

不确定性基于我们对影响评估中使用的信息相关性的信心。这些信心被分配在1到7的评分范围内；较低的分数反映出更高的信心。不确定性排名（1、2、3、5和7）旨在反映从表4中列出的各种信息来源获得的知识所带来的信心程度。对于没有信息的新属性，结果是最高的不确定性（7）。在相关产品中，某一属性的已发布数据也被认为具有高度的不确定性，当数据是由外部来源生成，并且没有详细的第一手知识可用时（5），例如关于Fc寡聚甘露糖结构的药物动力学影响的已发表研究。关于评估的特定分子的非临床数据和体外或计算机数据，或关于类似类别分子的内部临床数据，提供中等的不确定性（3）；例如，关于帕妥珠单抗电荷变体的药物动力学研究。临床研究考察了有关该分子的特定属性的影响时，提供最低的不确定性（1或2）。如果变体在包括I到III期的临床试验中使用的材料中存在，则对免疫原性和安全性影响的分配不确定性较低，前提是该变体的临床水平限制了声明高信心的定量范围。

表4：风险排名和筛选工具的不确定性量表

关于安全性和免疫原性，从临床研究得出的确定性只能延伸到在临床上实际测试的材料水平。对于潜在安全性和免疫原性问题的属性，所有相关信息，而不仅仅是临床观察，都将被纳入影响评估。对于一些关键质量属性（CQA），例如高分子量物种，根据文献，可能会普遍对免疫原性风险有更高的担忧，这可能需要根据这些外部信息提高CQA的影响评分。

对于PK，只有在临床中通过针对特定个体或物种类别的清除研究确定了QA的清除情况下，才适用非常低的不确定性。低（2）和非常低（1）不确定性通常不适用于生物活性，因为针对特定变种的临床评估很难进行评估。一般来说，高不确定性分数标识出需要进一步研究的属性，当更多具体和相关的信息变得可用时，影响评估可以降低。

4.5.3.风险排名和筛选评估

最后，每个pCQA的整体关键性排名通过计算其对安全性和有效性的危害风险来评估。每个pCQA（产品变体或流程相关杂质）的相对风险评分通过将影响分数和不确定性分数相乘获得。每个类别（生物活性、药代动力学、免疫原性、安全性）中属性的最高风险评分用于将QA分类为CQA或非CQA。在任何单一影响类别中，风险评分超过13（不包括影响为12、不确定性为1的组合）的属性被视为CQA（见表5）。基于几个已知的许可单克隆抗体的高风险和低风险QA示例，应用CQA RRF工具选择13个作为截止点。，建立了已确定的高风险属性的风险评分均高于13。例如，对于静脉给药，文献中已经很好地建立了C端赖氨酸对患者安全性或有效性没有风险。因此，不影响（2）与应用文献的不确定性较高（5）的组合仍然应该导致风险评分低于临界值的结果。特别在体外实验中测试的变体，如果在生物学或PK上没有超过20%的变化，则不应视为CQA。另一方面，具有中等、高和非常高影响的QA将保持为CQA；影响强烈推动表格，降低不确定性不会将这些属性转移到低风险属性类别，除非相应降低影响分数。影响为12和不确定性为1的组合代表了对临界值筛选的保守例外，但这是合理的，因为确定影响确实存在。

表5：产品变体和工艺相关杂质的风险评分

该工具的第二个重要限制是，对于没有相关信息的任何属性，默认得分为高影响（影响得分为16）和非常高的不确定性（不确定性得分为7），直到有足够的信息可用于降低评分。这种方法在早期开发阶段的应用能够识别出高风险的产品变体和杂质，这些变体和杂质应该进一步研究，以便根据获得的新信息降低不确定性和/或影响。理想情况下，在提交申请时，额外的信息将使得评估和不确定性得分的精细化成为可能。

4.6.属性交互和稳定性考虑

针对CQA识别的RRF设计旨在根据特定分子及其临床适应症提供保守评估。根据单克隆抗体（mAb）展现的作用机制数量，作为CQA分类的属性数量会有所不同。此外，对安全性和有效性可能产生影响的属性，如细菌内毒素和无菌性，已被归类为强制性CQA。

RRF方法对CQA进行逐个属性评估。尽管大多数mAb质量属性可能已被分类为关键属性，但质量属性之间的潜在相互作用和稳定性影响可能会影响影响评分。在最终决定属性测试要求时，这将是一个重要的考虑因素。因此，还需进行额外评估以捕捉这些潜在的属性相互作用和稳定性影响。

CQA的潜在相互作用可能导致更高的影响水平。例如，稳定性可能受到残留蛋白酶（可通过宿主细胞蛋白杂质测试测量）和/或中性蛋白酶的金属离子辅因子的影响。基于系统多元分析的CQA相互作用评估不可行，因为可能的组合太多。可以进行考虑潜在相互作用的差距评估，这可能导致CQA影响等级的提高。

互动差距评估应考虑所有质量保证，包括产品变体、与过程相关的杂质和根据临床前和临床信息、产品稳定性信息、相关文献和平台知识，强制性的关键质量属性（CQA）。在应力条件下观察到的意外变化可能表明质量属性之间的相互作用。

这种对CQA相互作用的额外评估分为两个类别：

1.那些协同影响生物活性、药代动力学、免疫原性或安全性（比如宿主细胞DNA/脂多糖）。协同效应来源于两个或多个质量属性（QAs）之间的相互作用，产生的效果大于其单独效果的总和。这些需要在关键质量属性（CQA）评估中反映出来。

2.那些影响稳定性的因素（例如，顺序或同时变化导致进一步降解或在其他特性中引起稳定性问题，如宿主细胞蛋白酶/低分子量物质（LMWS））。这些需要在控制系统中考虑。

5.产品生命周期中的关键质量属性(CQA)

在产品开发过程中识别出假定的关键质量属性（CQA），并根据不断增加的产品和平台知识更新其关键性评估。最终的CQA在第三阶段临床研究的后期通过本章所述的系统和基于风险的关键性评估重新定义，并随后在注册档案中提交给卫生主管部门进行审查。如果有必要，批后提交中会对CQA进行修订和更新。例如，第四阶段临床发现、新的适应症/患者群体考虑或通过改进的分析方法（更好的灵敏度分辨率）或外部出版物识别出新变种都可能触发重新评估。C-末端赖氨酸代表了一个CQA的例子，其中其关键性评估依赖于给药途径，如果给药途径发生变化，则可能需要重新评估。对CQA的总体审查也由批后生命周期计划（PALM）指导。

CQA影响和不确定性评分预计会在整个开发过程中发生变化，并且随着产品理解的增加和新信息的可用性，可能会在批准后发生变化。具有高不确定性和/或高影响力的属性可能会被选定进行额外研究以增加理解。在某些情况下，基于新数据，默认假设的高影响（16）可能会减少到低影响（4）。

6.CQA识别的示例

在以下内容中，呈现了我们应用CQA RRF工具的各种分子的例子。有关评分的概述，请参见表6。CQA评估被认为具有高度的分子特异性，结果不能广泛应用于其他分子。然而，如果有合理的依据，一些结构-功能研究的实验数据可以用于相关分子的评估。

表6：所选单克隆抗体产品变体的风险排名和过滤

6.1.去糖苷化(CQA)

Fcg RIIIa的结合亲和力以及随后通过人IgG1抗体引发的效应功能（如抗体依赖性细胞毒性（ADCC））在很大程度上依赖于与蛋白质Fc区域相连的碳水化合物部分。大量实验证据已证明核心岩藻糖在ADCC活性中发挥的关键作用。核心岩藻糖残基的缺失（即，位于寡糖还原末端的GlcNAc残基上的a1,6-连接岩藻糖）赋予抗体更高的ADCC活性。ADCC是许多细胞毒性抗体的关键作用机制。基于重组1,4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III（GnTIII）和α-甘露糖苷酶II（ManII）的过表达的糖工程技术导致更高的岩藻糖化，从而与未修饰的抗体相比显著提高了ADCC生物活性。

在开发批次中，通过将属性水平的数据与效力结果进行关联，可以评估去伪糖基化水平对抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）生物活性的影响。由于去伪糖基化是影响ADCC生物活性的主要参数（与其他糖苷特征相比），可以建立一个明确的相关性，计算ADCC的生物活性变化与聚焦化水平的变化。观察到一些残余方差，这可能是由于其他影响ADCC生物活性和测量变化的次要因素造成的。

去氟糖抗体的水平对生物活性产生重大影响，对于高去氟糖水平的抗体，ADCC生物活性的变化预计可达到100%的变化。因此，根据体外数据，分配了16的高影响排名和3的不确定性。

alpha-1,6葡萄糖基转移酶缺失细胞系在糖苷酶抑制剂存在下产生的完全甘露糖化和去甘露糖化复合型糖苷的消除动力学在小鼠PK研究中是相似的，这表明核心甘露糖对PK没有影响。此外，抗体的酶促去糖苷化导致FcR结合率降低20%，通过SPR分析确定（相对于糖苷化对照）。然而，将去糖苷化样本应用于FcR亲和柱时，pH梯度洗脱保留时间没有显著变化。因此，FcRnSPR分析中的微小差异被认为不相关。去糖苷化被视为影响PK的糖苷变化的最大可能性。因此，对于PK赋予了4的低影响，并根据这些体外数据分配了3的不确定性。

由于存在不同程度的核心岩藻糖的物种已在临床试验中出现，目的是反映用于市场申请的给药途径和剂量，因此对免疫原性和安全性给予了较低的不确定性评分。免疫原性的影响被评定为低，因为内源性抗体上出现了去岩藻糖的糖链。安全性的影响被认为是中等（评分为12），因为有迹象表明，岩藻糖含量对特定的不良事件（如首次输注反应）有影响。

缺乏糖基化是一种关注的事项，因为它影响生物活性和安全性（表6）。

6.2.糖化在CDR中的作用（CQA）

非酶促蛋白质糖化是一个化学过程，发生在生物治疗蛋白的细胞培养生产中以及生物液体和组织中。还原糖（如葡萄糖和半乳糖）与赖氨酸残基的氨基和氨基端反应会导致糖化，这一过程在阿马多里重排发生之前是可逆的。

CDR糖基化对抗体生物活性的影响潜在很大，因为其轻链残基和两个重链残基中都存在赖氨酸，这分别位于LCDR和HCDR中。在强迫条件下（1M葡萄糖，10天，37°C），CDR中的赖氨酸经历了高度糖基化（>50%），通过LC-MS肽图谱分析显示糖基化对通过ADCC生物测定测量的效能（相对于对照的54±17%）有显著影响。因此，生物活性被赋予了高达16的影响等级。由于结论基于体外结果，因此不确定性较低。CDR中的糖基化不太可能影响PK，因为PK是由抗体的Fc部分介导的。

已经在健康受试者中识别出IgG的糖基化，没有发现自身抗体形成的迹象。由于糖基化发生在内源性抗体上，因此在给定剂量的抗体静脉注射用于预期指征时，没有安全性和免疫性问题。因此，IgG的糖基化预计不会影响免疫原性或安全性。不确定性较低，因为糖基化的材料已经存在于临床使用的材料中。

C-D糖基化因其对生物活性的影响（表6）被认为是CQA。

6.3.C-末端赖氨酸（非CQA）

预计基于重链基因序列存在的重链C端赖氨酸残基通常在从哺乳动物细胞培养中分离的单克隆抗体中缺失。人们认为这种缺失是由于一种或多种基础羧肽酶的活性造成的。在下面讨论的例子中，评估了C端赖氨酸变体对用于急性适应症的静脉注射抗体的重要性。在静脉注射的情况下，对于C端赖氨酸在体内的影响和命运的经验较少，需要考虑这些因素以进行CQA评估。

由于去除重链C末端赖氨酸而产生的与电荷相关的变体预计不会影响IgG抗体在静脉给药时的生物活性或PK。重链的C末端不在抗原结合Fab区的附近。与Fc受体（FcgR和FcRn）复合物的Fc片段的晶体结构显示，重链C末端并不参与Fc与Fc受体之间的结合界面。包含主要是C末端赖氨酸变体的分离IE-HPLC分数的效力数据完全有效（相对于不含C末端赖氨酸的对照组为101±5%）。

使用FcRnSPR程序分析富集的C末端赖氨酸水平的IE-HPLC分级结果表明FcRn结合速率较低（与RS相比低约10%），这表明基于体外数据对药代动力学的影响较小。此外，将IE-HPLC组分应用于FcRn柱时，pH依赖的保留时间几乎没有变化。

综合来看，这些研究表明重链C末端的形式（赖氨酸变异和脯氨酸酰胺化）不会影响抗体与目标、FcgR或FcRn受体结合的能力。根据文献和体外数据，这种抗体的生物活性和药代动力学影响分数分别被评为低（2e4），不确定性为中等（3）。

由于缺乏C端赖氨酸的形式存在于用于临床研究的抗体材料中，因此免疫原性和安全性的影响和不确定性评分相对较低。此外，C端赖氨酸变体预计不会影响免疫原性和安全性，因为它们很可能在体内迅速被去除：虽然内源性抗体的重链基因编码C端赖氨酸，但在循环抗体中未检测到。与此一致，治疗性单克隆抗体的C端赖氨酸在血清中迅速被去除。在所有类别中，C端赖氨酸形式被分配为低影响（2e4），并不被认为是关键质量属性（CQA）（表6）。

6.4.未配对的半胱氨酸（非CQA）

在抗体重链的Cys22和Cys96处的两个游离硫醇可以通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离。游离硫醇的身份通过肽图谱得到确认。

对包含Cys22和Cys96的游离巯基变体的IE-HPLC分析表明，这些变体对ADCC和CDC活性没有影响。此外，含游离巯基的Fab通过IE-HPLC纯化。游离巯基Fab和完整Fab对CD20抗原的结合在基于细胞的结合测定和ELISA中进行了测量。Fab中的未配对半胱氨酸对其目标结合没有显著影响。这些游离巯基被发现埋藏在疏水区域，无法在原生条件下通过Ellman的测定检测到。因此，生物活性被赋予了低影响评分（4）和中等不确定性评分（3）。

位于HC可变域中的半胱氨酸22和半胱氨酸96的两个游离硫醇位于FcRn结合位点之外。因此，该变体不应影响FcRn的结合。对PK分配了无影响（2）的评分和高不确定性评分（5）。

这对游离巯基在临床材料中存在于相当高的水平（约18%）。该评估初步基于I期和II期临床数据，并通过关键研究再次确认。罗氏还有另一种许可的单克隆抗体产品，其VH区域约有25%的未成对半胱氨酸，也具有非常低的免疫原性。因此，尽管未成对半胱氨酸理论上可能呈现出较高的免疫原性风险，但这并不是我们的临床经验。因此，免疫原性和安全性被赋予了低影响分数（4）和低不确定性分数（2）。

Cys22和Cys96处的自由硫醇被指定为没有影响分数（2），对于PK的低影响分数（4）用于生物活性、安全性和免疫原性，并被视为非关键质量属性（表6）。

7.学到的教训和未来的机会

CQA评估的目的是识别需要控制的质量属性。需要严格区分CQA评估（基于患者影响）与控制策略（也基于过程能力和稳定性）。

我们将CQA RRF工具应用于几种单克隆抗体的开发，支持了这一结构良好的CQAs识别程序。基于更好的分析工具和卫生当局的反馈，我们将继续完善评估影响的方法。在我们的CQA评估工具中，保守的影响分类只导致少数非CQA，由于非关键性证明的标准很高。例如，糖化在目前的监管提交中被保守地视为关键质量属性（CQA），因为这种变异无法在高水平上生成以评估其对功能的影响。然而，有证据表明，总体高抗体糖化与非糖化对照相比，对Fc受体的结合能力相当。由于包括抗体在内的血浆蛋白是天然糖化的，因此单克隆抗体的糖化预计不会影响其安全性和免疫原性。因此，对于某些产品，糖化已被定为非CQA。我们可能需要重新考虑，某些在分子保守区域的变异，既不涉及安全问题且几乎不会形成，是否可以被视为非关键性，考虑到在严苛压力条件下，较低的水平仍然不会转化为对功能的体外影响。一般而言，对于这种低丰度变异，我们将继续深入了解它们在现实和相关条件下的形成准备情况，以及它们对分子疗效和安全性的相关性。

开发合适的检测方法以模拟作用机制和毒性对于评估至关重要。这种评估工具还强调了需要改进体外方法以模拟清除机制。

分析技术因其能够以不断降低的水平检测新变异和已知变异而不断发展。随着这种分析灵敏度的提高，我们需要关注对于在微量水平上这些变异对患者影响的风险理解，并允许过滤，以便做出合理的决定将质量属性（QAs）纳入关键性风险评估。对于在应激实验中形成的变异，0.5%的阈值（在肽水平）可能被认为是合理的，以将低水平变异排除在pCQA列表之外，并且在应激条件明显超过生产过程和正常保质期的条件时可能进一步得到证明。这个阈值可能不适用于任何有潜在风险影响患者安全或免疫原性的质量属性。

在近期项目中，主要进行体外结构-功能研究以支撑质量保证的关键性排名。只有少数分子变体在给患者施用后，其进一步命运被很好地理解。C-末端赖氨酸在通过静脉注射进入患者体内时会被迅速切割，但对C-末端赖氨酸变异对皮下给药产品的药物动力学影响仍存在不确定性。然而，对于大多数分子变体及其位点依赖性，体内加工的理解仍然有限。从患者血清中回收样本可能提供有关变体关键性的进一步信息。

总体而言，我们将不断改善我们的分析技术以及对变异和杂质的理解，以影响产品质量。对文献的细致调查以及将我们自己的数据与新发表的与CQA评估相关的文章进行比较，是找到质量属性的正确评估和长期合理分类其相关性的关键。

8.结论

我们描述了可以将ICH Q8(R2) CQA定义转化为治疗性抗体实际应用的工具。确定CQAs是生物制药QbD开发的重要步骤。使用系统的科学和基于风险的方法提供了一个有纪律的逐步过程，用于评估和记录质量属性的关键性。如示例所示，对于两种已获批准的单克隆抗体质量属性的例子，确定过程依赖于通过质量属性的特征化获取的全面知识。使用基于风险的科学系统方法确定cqa是一个迭代过程，并且随着更多分子知识的可用性而不断发展。

在确定关键质量属性(CQA)之后，进一步的单克隆抗体质量源于设计(mAb QbD)开发包括制定控制策略和设计空间，这些内容在后面的章节中进行了描述。这些后续活动在很大程度上依赖于对关键质量属性的深入理解。

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