Nature | 方文雯/Andrei Korostelev/麻锦彪/凌小滨合作解析一种天然的RNA纳米笼结构

长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs，长度超过200个核苷酸）在生命过程中的多个方面发挥着重要作用。通过比较基因组学分析，科学家已在细菌和噬菌体中识别出超过20类lncRNA，但它们的生物学功能在很大程度上仍未被揭示。由于lncRNA分子普遍较大，其结构特征也大多尚未被明确。

近日，UMass Chan Medical School的方文雯、AndreiA.Korostelev、凌小滨和复旦大学麻锦彪合作（第一作者为凌小滨）在Nature上发表了文章Cryo-EM structure of a natural RNA nanocage。本文报道了来自细菌和噬菌体基因组的lncRNA——ROOL（源自瘤胃的、结构精巧的、大分子RNA）的两种天然RNA纳米笼结构。约2.9 Å分辨率的冷冻电镜（cryo-EM）结构显示，ROOL RNA可组装成一个八聚体纳米笼，其直径为28纳米，轴向长度为20纳米，内部呈中空结构，并包含部分无序区域。该八聚体结构通过大量三级和四级结构相互作用稳定，其中包括一种研究者们提出命名为“A-minor staples（A- minor 订书钉 ）”的三链A-minor相互作用。 约3.2 Å分辨率的ROOL单体结构显示，其纳米笼的组装过程涉及链交换机制，并形成四级亲吻环（kissing loops） 。最后，研究者们进一步展示了，当ROOL RNA与RNA适配体、tRNA或microRNA融合后，依然可以维持其纳米笼结构，并可将这些“货物”呈放射状展示。研究者们的研究成果为工程化构建新型RNA纳米笼，作为科研和治疗中的递送载体提供了潜在可能。

高度结构化的非编码RNA（ncRNA）在最基本的生物学过程中发挥着重要作用。众所周知的例子包括核糖体RNA和转运RNA（rRNA 和 tRNA），它们参与蛋白质合成；II类内含子，可介导遗传元件的转移；以及信号识别颗粒RNA（signal recognition particle RNAs），它能将分泌蛋白引导至细胞膜。比较基因组学分析还在细菌中发现了数百种其他结构化的非编码RNA，其中包括约20类长链非编码RNA（lncRNA），其功能目前尚不清楚。

ROOL RNA（rumen-originating, ornate, large RNA）长度约为600个核苷酸，最初在牛瘤胃的宏基因组数据中被发现，随后在人类病原相关的噬菌体基因组和至少三个细菌门中被鉴定出，其中很多细菌是生活在人类黏膜上的机会致病菌。另一种更长的长链非编码RNA，称为 GOLLD（Giant, Ornate, Lake- and Lactobacillales-Derived）RNA，长度约为800个核苷酸，仅次于23S和16S rRNA。该RNA被认为可能参与噬菌体裂解过程，但其具体功能仍然未知。ROOL和GOLLD RNA在基因组中常常位于tRNA旁边（有时甚至与之重叠几个核苷酸），并可在前噬菌体（prophage）中找到，这提示它们可能具有相关的生物学功能。ROOL RNA在一些乳酸杆菌（

Lactobacillus salivarius

众所周知，生物分子的三维结构决定其功能，但目前对许多长非编码RNA（lncRNA）的结构研究仍然非常有限。这一限制极大地阻碍了研究者们对lncRNA功能的理解以及其在科研或治疗中潜在应用的开发。 所以 本研究通过 单颗粒冷冻电镜解析了两个ROOL RNA的高分辨率纳米笼结构。

1） 与人工设计的RNA纳米结构相比，这种天然的RNA纳米笼具有更大的体积和更高的结构复杂性，凸显了自然选择在功能性RNA构建中的强大力量。 通过分析 维持该八聚体 纳米笼 结构的广泛三级与四级结构相互作用，尤其是普遍存在的“A-minor订书钉”（A-minor staple）相互作用，为未来lncRNA结构与功能的研究和设计奠定了基础。研究者们还解析了ROOL RNA单体的cryo-EM结构，并通过与八聚体的比较，揭示了一种优雅的“链交换”组装机制。

2） 研究者们 设计并测试了新型ROOL RNA构建体。结果显示，无论是扩展笼内空间，还是在笼体外融合aptamer、pre-tRNA或pri-miRNA，都不会破坏其八聚体结构，这表明ROOL纳米笼具有作为RNA递送系统或其他治疗工具的巨大潜力。

在本研究中，研究者们利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）分析，解析了两种长度为580 nt的ROOL RNA的结构：分别来自肠球菌 Enterococcus faecalis JH1 的 ROOL Efa （2.94 Å）以及来自 Firmicutes bacterium CAG:227 的 ROOL Firm （2.93 Å），这两种细菌均为革兰氏阳性菌，属于厚壁菌门（

Bacillota

Firmicutes

Enterococcus faecalis

Firmicutes bacterium

Lachnospiraceae

图 1. ROOLEfa 和 ROOLFirm 的冷冻电镜（Cryo-EM）分析

每个单体由 16 个螺旋区域（H1–H16）组成，这些区域通过广泛的三级结构相互作用稳定了单体略微弯曲的构型。这些三级结构相互作用包括接吻环（kissing loops）、三链的 A-minor 相互作用、碱基堆叠、Z-anchor 锚定结构，以及由碱基三联体介导的 90° 转角。研究者们提出使用术语“A-minor 订书钉（staples）”来描述这些三链 A-minor 相互作用，以对应三链 RNA 结的命名方式。

在所有的螺旋间相互作用中，接吻环和 A-minor 相互作用占了大多数。在 ROOL Efa 中，最显著的接吻环出现在 H11 和 H12 中，对应核苷酸 303–306 与 359–362 之间，由四个沃森-克里克碱基对稳定结合。如后文所述，该相互作用对八聚体的组装至关重要。H6 中的富含腺嘌呤（A-rich）环也与 H8 的富 A 内环形成类似接吻环的相互作用，其中 A148 和 A149 与 U205-A336 与 C204-G337 成对，形成碱基三联体。此外，ROOL Efa 中存在大量的分子内 A-minor 相互作用，这也是大多数 RNA 分子中最丰富的三级相互作用。A-minor 相互作用通常涉及两个连续的腺苷，插入目标 RNA 螺旋的小沟中，其核糖部分通过氢键靠近结合。这类相互作用在 RNA 的稳定性和分子识别中发挥关键作用，例如四核苷酸环-受体识别（tetraloop-receptor recognition）、tRNA 解码 mRNA、以及 tmRNA 在核糖体中的稳定性。

在 ROOL Efa 中，一个引人注目的 A-minor 订书钉涉及 A218 和 A219，同时 A96 堆叠在其上方，将 H4、H9 和 H10 三个螺旋结构连接在一起。这一连接点还由另一个 A-minor 订书钉增强，后者包含 A295、A296（位于 H10）与 A216（H9）堆叠后对接于 H4。在这两个 A-minor 订书钉中，非连续腺苷提供了堆叠平台，但其核糖并未与相应的小沟形成氢键。这些相互作用也促使单体形成八聚体的构型。

图 2. 三级结构相互作用稳定 ROOLEfa 单体在纳米笼中的构象。

ROOL Efa 四聚体中单体的放射状排列主要通过 kissing-loop（接吻环）和 A-minor 相互作用进行稳定。四重对称轴被每个单体的 H9 螺旋包围，这些 H9 螺旋彼此对接。每个四聚体包含四个二聚体界面，在每个界面中，两个单体之间通过四种主要相互作用稳定连接：上述的 H9 对接、两个 kissing-loop 接触以及一个 A-minor 相互作用。H10 的环（位于核苷酸 262–264）与 H8 和 H10 之间的内环（核苷酸 287–289）形成 kissing-loop 结构，形成了三个 Watson-Crick 碱基对。另一处 kissing-loop 接触由一个单体的 H2 环突入另一单体的 H12 区域形成，在核苷酸 42–45 与 420–423 之间形成四个 Watson-Crick 碱基对。这一对接螺旋轴向堆叠在 H12 的其余部分上，而 H12 的骨架又与上述的 H11–H12 分子内 kissing-loop 构成 ribose zipper（核糖拉链结构）。这说明更高阶结构的装配与单体内部构象之间存在着精细的依赖关系。涉及三个连续腺苷（A318–320）的 A-minor 相互作用将一个单体的 H11 与相邻单体急剧弯曲的 H3 联结在一起。其中，A318 堆叠于 Hoogsteen-ribose A166-G65 碱基对中的腺苷上，而 A319 和 A320 分别贴合于由 G64 和 G167-U63 形成的小沟中。

图 3. 四级结构相互作用稳定 ROOLEfa 八聚体结构。

ROOL Firm 的结构与 ROOL Efa 几乎完全相同，突显出 RNA 四级结构的保守性。三维比对显示，由于四聚体排列上的微小错位，ROOL Firm 和 ROOL Efa 的八聚体不能完全重叠。研究者们注意到，八聚体的整体形状可能受到纳米笼中无序连接区的影响 。 为了测试这些区域是否对八聚体的组装至关重要，研究者们构建了缺失一个或两个连接区的 ROOL Firm 突变体。负染电镜结果显示，这些突变体颗粒的形状几乎与野生型 ROOL Firm 相同。

在两个 ROOL 八聚体中，其 5′ 和 3′ 末端共同构成了从纳米笼外部突出的 H1 螺旋结构。为此，研究者们设计了三个构建体，将三种不同的 RNA cargo 分别通过体外转录方式融合至 ROOL Firm 的 3′ 末端。这三种 RNA cargo 包括：51 个核苷酸的 Mango-III RNA 适配体（Mango-III aptamer），可用于通过荧光成像追踪 ROOL RNA；一个 163 个核苷酸的抑制性 tRNA 前体；以及一个包含人类 miR-1-1 的 143 个核苷酸的原始 microRNA（primary-miRNA）。该抑制性 tRNA 是通过对 tRNA Ser 进行改造而设计的，在人类细胞和小鼠中具有较强的终止密码子读取（stop-codon readthrough）能力，未来可能用于治疗应用中。负染电镜结果表明，所有这三个构建体的粒子形态都与野生型 ROOL 所形成的八聚体相符。此外，在二维分类图中可见从 ROOL Firm 颗粒辐射出的额外电子密度，表明这些额外序列呈现出相对有序的构象，这可能得益于结构刚性的 H1 螺旋对其起到了限制作用。

总之，无论是对纳米笼内部序列的扰动，还是在其末端融合长达 163 个核苷酸的 RNA cargo，都不会破坏 ROOL Firm 的多聚化 纳米笼 结构。

图 4. ROOLFirm变体的分析。

研究者们 也解析了 未组装的 ROOL Efa 单体，其结构分辨率达到了 3.25 Å。该未组装单体的核心形状与八聚体纳米笼中的单体相似，但其中两个主要差异表明：在形成八聚体过程中，多个螺旋区域经历了显著的重构。第一个显著的重排涉及 H8、H9 和 H10 螺旋。在八聚体单体中，这些螺旋通过 A-minor 相互作用与 H4 紧密结合，使得 H8 和 H10 之间的内环（核苷酸 286–292）暴露出来，进而参与分子间 kissing-loop 相互作用。然而，在游离单体中，H8–H9 相较于 H4 向外偏移了约 23 Å，且该内环似乎已成为 H8 的延伸部分，而 H9 和 H10 呈现无序状态。因此，该区域在单体中形成了与八聚体中所需的分子间相互作用截然不同的结构。第二个显著差异涉及 H12。在八聚体中，H12 形成的是紧凑的分子内 kissing-loop 相互作用（位于核苷酸 359–362），并由 365–420 区域的无序连接片段连接。而在游离单体中，H12 形成了一条超过 100 Å 的长螺旋，包含 346–433 的碱基序列。尽管该区域的密度较低，难以完整建模，但 H12 的螺旋干区在 ROOL Efa RNA 核心附近清晰可见。值得注意的是，在八聚体中参与分子间配对的残基 420–423，在单体中则与其他碱基配对，且通过螺旋内堆叠相互作用稳定。因此，该区域需要进行大约 41 Å 的链交换（strand swapping），才能与 H2 的环区发生分子间相互作用。

图 4. 单个 ROOLEfa 单体的结构。

细菌体内具有多种细胞器，用于完成不同的功能，包括存储或隔离特定代谢物和酶、提升生命活动的空间调控效率，以及增强代谢过程的效率。研究者们在此描述的 ROOL RNA 所形成的引人注目的纳米笼结构，暗示其可能在细菌或噬菌体中作为封装或运输工具使用。其内部空腔足以容纳 tRNA（无论是否与 tRNA 结合蛋白 EF-Tu 结合）、mRNA 或其他 RNA/核糖核蛋白复合物。

ROOL RNA 的结构揭示了广泛的分子内与分子间相互作用，为其多聚体纳米笼的组装与解体机制提供了见解。常见的 kissing-loop 和 A-minor 相互作用，包括研究者们提出命名的 “A-minor 订书钉（staples）”，是 ROOL 分子内部结构以及四聚体分子间堆叠的基础。这些独特的相互作用很可能介导 ROOL 纳米笼在细胞内的动态调控。研究者们的工作还深入解析了八聚体组装关键的相互作用机制。将 ROOL 八聚体与其单体结构进行比较发 现，仅需两个局部链交换即可促成两个 kissing-loop 的形成，使得单体通过二聚组装连接。RNA 的链交换机制与蛋白质链交换驱动的寡聚化现象十分相似，这表明两种截然不同的生物聚合物演化出了相似的结构复杂化策略。

目前 RNA 纳米笼的发展仍以简单的碱基配对与有限的三级结构设计为主。天然 RNA 纳米笼如 ROOL 的发现，有望通过增强 RNA 聚合物的热力学、药物学与治疗性质，拓宽其治疗应用。研究者们的研究还表明，即使移除 ROOL 笼体中无序的环结构，其八聚体结构仍能维持稳定，为未来设计笼内装载物铺平道路。此外，在 ROOL RNA 两端融合适配体（aptamer）或 tRNA/miRNA 的前体序列，也不会破坏其八聚体结构。因此，研究者们相信ROOL 作为天然 RNA 纳米结构，具有广阔的工程化前景，可为治疗开发提供新平台。

https://www.nature.com/articles/s41586-025-09262-x

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