单克隆抗体工艺中的宿主细胞蛋白（HCP）：控制、检测和清除

摘要：宿主细胞蛋白（HCP）是使用细胞培养技术表达的治疗性蛋白质中与工艺相关的杂质。本文从单克隆抗体（ mAb ）生物工艺中的 HCP 以及下游单元操作清除 HCP 的能力方面介绍了生物制药行业的趋势。对制造过程中当前实施的技术和新兴技术进行了全面评估，并提供了广泛的参考资料。对已发表的下游数据进行了总结分析以确定趋势。改进的分析方法和对 “ 高风险 ”HCP 的理解可以带来更稳健的制造工艺和更高质量的治疗药物。更高细胞密度培养的趋势导致更高的 mAb 表达和更高的 HCP 水平。然而，随着操作的改进， HCP 水平可以显著降低，从而产生相似浓度的约 10ppm HCP 。最近增强的下游操作与传统批处理之间的 HCP 清除性能没有差异。本综述包括开发改进流程的最佳实践。

【NO.1】引言

单克隆抗体（mAb）近年来获得卫生当局批准的数量最多，是目前最重要的一类重组蛋白治疗药物。大多数mAb生产工艺使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系来表达生物治疗药物，并从收获的（澄清的）细胞培养液（HCCF）中回收。宿主细胞蛋白杂质（HCP，通常称为CHOP）从活细胞分泌到HCCF中，并在培养和收获过程中通过细胞裂解释放。HCCF中HCP的数量和成分因所选克隆、mAb表达、生物反应器类型和培养条件而异。

HCP是源自表达mAb的细胞的工艺相关杂质，并且可以包括数千种浓度、分子量、等电点（pI）和表面电荷差异很大的独特蛋白质。

HCP被归类为治疗性mAb生产中的关键质量属性（CQA）。许多HCP对于细胞的关键代谢途径至关重要，但在百万分之几（ppm）浓度下可能会对患者安全构成风险。它们可以在免疫功能低下的患者中引起免疫反应（免疫原性）或通过具有生物活性。它们可以改变mAb的稳定性或溶解度，并可以酶促攻击mAb治疗药物以改变其效力。虽然大多数HCP没有酶活性，但一些HCP成分可能显示脂肪酶，糖苷酶或蛋白酶在mAb酶促分解中的行为并可能促进mAb制剂中的聚集，从而影响保质期。

卫生当局（例如，美国食品和药物管理局[FDA]和欧洲医疗署[EMA]）未就要注射给患者的最终药品中HCP总量的具体可接受水平提供书面指导。然而，HCP的非正式经验目标水平为<100ppm或<100ng/mg产品。从HCP分析技术和免疫原性测定的最新发展来看，100ppm的限值不足以确保药物稳定性和患者安全。最终产品中HCP的可接受水平由风险评估确定，并取决于多种因素，包括浓度、治疗剂量、给药频率、药物类型和疾病的严重程度。因此，确保产品安全有效需要能够稳健地控制和去除HCP的制造工艺，以使最终产品的HCP水平既不影响产品质量，也不会影响患者安全。这可能需要监控和限制一部分“高风险”HCP。

许多生物制药制造商正在探索新的单元操作和工艺强化，将高细胞密度培养与下游单元操作串联起来，作为一个连续工艺运行。尽管这些经常被讨论为更高的生产力和更低的商品成本，但管理HCP是患者安全的关键质量属性。通过延长生产时间来提高mAb滴度的上游开发会导致细胞密度和活力发生变化，这可能导致更高的HCP水平和改变的组成。这给下游纯化带来了更高的去除挑战和HCP检测。

这篇综述涵盖了与HCP作为CQA相关的当前生物制药行业趋势，以及用于分析分析和制造工艺的创新技术。通过对HCP的上游生成、控制和下游去除文献的全面评估，分析了过程中HCP水平和清除率的数据。

【NO.2】法规和质量方面

HCP的水平和类型取决于用于产品表达的宿主细胞和克隆以及下游制造过程。在29种已获批的mAb和基于mAb的治疗药物中测定的单个HCP的相对水平通常较低，平均为20ppm。对HCP的临床反应取决于几个因素，包括患者群体、剂量、给药途径和频率等。例如，为治疗类风湿性关节炎等慢性疾病而反复使用高剂量mAb可触发患者对mAb治疗药物的免疫反应。与用于治疗癌症等急性疾病的低剂量mAb治疗药物相比，在此类产品中，需要更高水平的HCP。

全球卫生当局和行业已经使用质量源于设计（QbD）方法制定了质量管理框架。该框架旨在设计和管理患者安全和产品质量流程，并基于可靠的科学和质量风险管理（国际协调委员会，ICH Q6B（1999）、S6R1（2011）、Q8R2（2009）、Q9R1（2023）、Q10（2008）和Q11（2017））。HCP是一种CQA（ICHQ11）。在QbD中，确定与HCP去除相关的关键工艺步骤，首先要利用先验知识和HCP去除研究，以及风险评估。根据将工艺性能与三个色谱步骤联系起来的多变量统计模型，描述了为下游工艺中HCP清除建立单元操作作为限制的设计空间。上游加工条件会改变HCP成分，从而影响下游去除HCP的工艺。

必须监测和管理HCP水平以确保可接受的水平（ICH Q6B）。然而，不可能为不同的mAb提供普遍接受的残留HCP水平，因为每种针对残留HCP的免疫测定对几乎无限的HCP组合的反应性都是独一无二的。HCP组成受宿主细胞系和生产工艺条件的影响。因此，法规中没有规定具体限制，监管机构使用基于风险的方法逐案审查HCP的可接受水平。HCP检测指南强调，水平应尽可能低，但未说明残留水平的具体目标（美国药典专论<1132>2016年，欧洲药典专论2.6.342017）。HCP规格应基于对过程和产品的系统理解以及科学知识来确定。

HCP的风险可以从SOD（S-严重程度；O-发生率；和D-可检测性）框架。从监管的角度来看，风险评估中要考虑的因素是HCP的身份及其与人类对应物的同源性、先前使用材料的经验、临床适应症/人群、治疗作用机制、给药途径、发展阶段、暴露持续时间和给药频率。

从对79种市售生物治疗产品的分析中观察到一组29种HCP。从中确定了几个有问题且难以去除的HCP。这些包括mAb产物结合的物种，如nidogen-1、分泌蛋白酸性和富含半胱氨酸的蛋白（SPARC）和聚集蛋白。此外，组蛋白等物种可以与蛋白A层析法中的mAb共洗脱。酶促HCP（如脂蛋白脂肪酶）在加工和产品储存过程中的稳定性存在问题。免疫原性HCP兴奋剂，如磷脂酶B样蛋白，也需要更高水平的清除率。鉴于存在大量独特的HCP，不可能测试每一种HCP的免疫原性和酶效应。计算机模拟和数据库审查相结合，用于预测哪些残留HCP是高风险的。这应该在下游工艺开发的早期阶段完成，以便能够设计下游工艺。如果HCP物种在纯化过程中持续存在，则可能会产生基因敲除细胞系。CHO蛋白预测免疫原性（CHO PPI）是一种计算机模拟工具，可预测CHO蛋白的潜在免疫原性风险以及CHOP表达和分泌的潜在存在。免疫表位数据库（IEDB）也有评估免疫原性风险的算法。这些考虑因素可能需要监测“高风险”HCP成分的子集。为了帮助确定针对单个HCP阈值的建议，一个由26家公司组成的行业联盟开发了一个可搜索的“高风险”HCP数据库，该数据库将继续更新。该数据库编制了一份包含86种常见HCP的综合清单，其中HCP根据其影响被归类为“高风险”HCP（表S1将此信息总结为支持信息）。

许多治疗药物（例如Xigris、Aranesp和Aldurazyme）已获得批准，但前提是进行持续的患者监测（IV期临床试验）以确定CMC规格可能发生变化的不良反应。

【NO.3】HCP检测和表征的分析方法

HCP检测的主要关注点是它们对整个HCP人群的覆盖率及其敏感性，尤其是对“高风险”成分的敏感性。在HCP检测方法中（表1），酶联免疫吸附测定（ELISA）是最常见的。HCP ELISA检测可分为3大类：通用、平台和工艺特异性HCP检测。基于抗体的检测化学包括直接和夹心ELISA检测、比色测定和基于荧光的检测。虽然特定于工艺的HCP检测是专门为工艺和表达系统开发的定制版本，但平台HCP检测意味着使用为类似的纯化工艺和菌株（即来自共同起始细胞系的菌株）开发的相同内部检测。但是，应谨慎使用平台HCP分析，因为HCP模式可能会随着纯化过程和生物分子的变化而有所不同。监管机构通常要求在临床后期进行针对特定工艺的HCP检测，除非可以验证仿制药或平台HCP检测以涵盖工艺中存在的HCP范围。ELISA的有效性还取决于抗原的生成和纯化，以及检测方法的开发方式。用于市售通用检测的抗原可能差异很大，从无效细胞培养物到肽构建体和蛋白质片段。测试抗体对HCP的特异性至关重要，因为许多抗体，尤其是由肽构建体或蛋白质片段产生的抗体，可能无法识别实际的靶标HCP。即使使用来自无效细胞系的细胞培养上清液（CCS）作为抗原也有局限性，因为可能无法有效产生针对低免疫原性的抗体或低丰度HCP的HCP中。此外，由于在靶标mAb表达过程中不存在那些仅分泌的HCP，因此也不会产生针对此类HCP的抗原。

表1.mAb生产中使用的HCP分析方法的主要特征

除ELISA外，其他基于抗体的方法包括2D凝胶电泳（2D-GE）联合考马斯蓝、银或荧光蛋白染料染色来检测蛋白质，或蛋白质印迹（WB）来检测免疫原性反应。我们使用CHO表达的澄清模型mAb进行考马斯蓝和银染的2D染色凝胶的内部数据提供了HCP多样性和相对水平的定性图片（图1）。这些凝胶可用于制定HCP去除策略。在这种情况下，大多数CHOP组分的分子量范围为5–6.5pI（在pH值为7时带负电荷），分子量为30–200kD，并且主要具有亲水性。银染非常敏感，可以检测非常低浓度的蛋白质。使用已知浓度的参比蛋白加标样品可用于校准条件并帮助解释。

图1：2D Polyacgrlamide凝胶电泳（2D-PAGE显示HCP的分子量（垂直）和等电点（水平）分布，在97%活力下获得澄清的CHO收获

使用二维荧光差异凝胶电泳（2-DDIGE）显示CHOP的多样性。2-DDIGE识别了多达800个不同的点。这给HCP分析带来了独特的挑战，因为理想的检测方法必须能够在高目标mAb浓度下以高灵敏度测量宽动态范围。可以通过对相关HCP浓缩物进行加标研究和在生产条件下运行的工艺来证明HCP清除能力。

卫生当局已要求使用正交方法进行测试，例如液相色谱-质谱法（1D或2D-LC-MS/MS）。为了提高检测限（LoD），各种样品连接策略包括将早期、中期和晚期高pH-RPLC（反相液相色谱）馏分合并为单个馏分。在2D-LC-MS/MS分析期间或之前，已采用亲水作用色谱（HILIC）进行预浓缩以富集HCP，然后进行离心真空浓缩。获得的LC-MS数据通过数据依赖型采集（DDA）或数据非依赖型采集（DIA）进行分析。DIA涉及创建谱库和所有母离子的碎裂，因此比DDA更费力。这种方法既可以识别和定量存在的HCP，也可以与蛋白质的免疫原性无关。LC–MS/MS还可用于分析HCP ELISA的覆盖率，而不会因抗体敏感性或白带转移效率而产生偏差。LC–MS/MS主要用于工艺开发和故障排除，而ELISA主要用于常规批次放行检测。这是因为ELISA一旦经过验证，就是一种比LC-MS/MS更简单、更快速的方法。在故障排除过程中，调查了使用ELISA生成的意外HCP结果，从而通过LC-MS/MS鉴定出共纯化HCP，并随后进行风险评估。

使用高pH值-低pH值二维反相（RP）LC-MS/MS方法的新开发可以检测出低浓度的HCP，约为10ppm。研究表明，2D-LC与离子淌度质谱联用可将HCP的检测限降低至1ppm。在LC–MS/MS之前实施单步截留分子量过滤，然后进行鸟枪法蛋白质组学分析，可以显著提高低丰度HCP的检测。通过LC-MS/MS获得的HCP谱图（<200kDa，在4–11pI的广泛分布中具有更高的酸性pI比例）显示出与图1中所示的2D凝胶相似的谱图。LC–MS/MS能够覆盖每种HCP组分的细节。

一个公开可用的、全面的、CHO特异性谱库，具有所有理论质谱的顺序窗口采集（SWATH-MS），已鉴定出10000多种蛋白质，由199102种鉴定出的肽组成。作为未来的过程分析技术，它有可能通过对肽进行定量分析来帮助更详细地表征HCP。

其他正在开发的方法包括序列定义的、基于适配体（SDAB）的流式细胞术结合测定和邻位连接测定。SDAB检测具有识别非免疫原性HCP的独特优势，但32个DNA适配体可以识别多种抗体的事实表明，每个适配体对抗体没有特异性亲和力。这可能对使用适配体作为平台检测构成挑战，因为32种适配体中的每一种也可能与靶蛋白结合。显影过程也相当繁琐，因为如果磁珠表面的包被没有完全完成，每轮通过指数富集（SELEX）系统进化配体都容易富集背景基质结合适配体。

上游工艺也直接影响CCS的HCP含量。值得注意的是，高活力细胞系和基因敲除细胞系的开发可能通过降低蛋白质基质的复杂性来促进HCP检测。另一方面，据报道，使用补料分批培养比分批培养增加总体HCP含量。如果可以开发一种实时和在线方法来监测这种现象，尤其是对于灌注模式下的连续处理，那将是理想的选择。目前，没有关于快速检测HCP的合适在线方法的报道。

每种商业批准产品的HCP概况都是唯一的。通过2D-LC-MS对几种mAb下游工艺中的单个HCP进行全面追踪，观察到纯化中间体中差异很大的HCP数量和水平来自一小部分细胞内HCP。使用带有iTRAQ8重标记的UPLC-MS/MS将两种CHO宿主细胞系产生的上清液与一些转染/未转染克隆进行比较，结果显示鉴定出的数百种蛋白质没有显著差异。然而，宿主和转染克隆的蛋白质之间的表达略有不同。通过2D-DIGE在5种不同细胞系的15个CHO无效细胞培养收获物中也发现了非常相似的HCP组成。这种相似性可能表明HCP杂质不受各种制造工艺的显著影响。对于生物仿制药mAb，卫生当局要求与原研mAb相似的mAb产品概况和HCP含量。然而，目前尚不清楚如何为这么多不同的HCP实现相似的身份和数量。因此，在开发生物仿制药时，临床试验是必要的。HCP的存在可能会增加或降低药物疗效。尽管人们普遍认为，去除HCP的纯度较高的mAb应该具有更好的安全性和有效性，但需要进一步测试以证明HCP水平特别较低的生物仿制药mAb在疗效或安全性方面是否存在差异。

通过分析技术的不断进步，下一个目标是（1）在不影响灵敏度的情况下加快检测时间，以及（2）改进对HCP风险因素的预测（通过提高计算机模拟和共享数据库分析的质量）。更快的检测时间将允许分析更多的样品，从而可以确定HCP在不同上游培养条件、下游纯化阶段和安全限值下的分布。对HCP浓度的快速反馈有可能实现基于过程分析技术（PAT）的过程参数反馈控制，从而提高生物反应器或下游纯化步骤的产品质量和效率。更好地预测HCP风险因素有助于研究有问题的蛋白质并生成共享数据库。

【NO.4】上游生物工艺中HCP的控制

如引言中所述，HCP在培养过程中通过分泌、细胞死亡和细胞裂解产生并释放到HCCF中。在影响HCP丰度和物种的参数中，收获时的细胞活力可能影响最大。CMC生物技术工作组进行的QbD案例研究通过实验设计（DoE）得出结论，p<0.0001，影响HCCF中HCP的唯一参数是培养物收获的持续时间。HCP控制精度为3–8×106PPM将该参数的生物反应器设计空间范围限制为15-19天。优化上游工艺可以减少HCP的负荷，并可能提高下游工艺的效率，以达到最终药物中HCP的目标水平。然而，由于在实现关键质量属性方面存在其他限制，因此在上游加工中满足HCP控制的设计空间是一项挑战。HCP控制的综合方法涉及下游纯化。

4.1生产细胞系

生产细胞克隆产生目标mAb，同时在此过程中产生HCP并将其分泌到培养物中。其中一些HCP可以在生产过程中降解培养物中存在的mAb，还可以引发免疫功能低下患者的免疫反应，从而对患者的安全构成风险。一种方法是减少细胞系对HCP的表达，并创建“清洁”的生产细胞系。在Dovgan等人（2021年）的一项研究中，组织蛋白酶D（一种难以还原的HCP）的下调大大降低了共纯化HCP的水平。其他细胞系工程靶点可以是细胞凋亡相关基因，从而通过设计更健壮的细胞系来减少HCP，这些细胞系对细胞凋亡有抑制作用，并且能够在较长的培养时间内保持较高的细胞培养活力。另一种方法是直接筛选候选CHO细胞系和生产克隆，以减少有问题的HCP的表达以及促进产品降解的酶。

4.2细胞培养基

细胞培养基中的成分可以改变HCP的组成。较高浓度的胰岛素、叶酸、甘氨酸和核黄素会降低HCP浓度；相反，添加氯化镁（MgCl2）增加了他们。在该研究中，HCP群体向较低的pI值转变，有利于其被下游IEX色谱柱清除。通过添加胰岛素、叶酸、甘氨酸和核黄素，可以降低HCP水平，而mAb生成没有显著影响。尽管MgCl浓度提高增加了HCP水平，目前对细胞培养基成分对HCP生产影响的机制知之甚少。了解细胞培养基成分减少HCP背后的机制有助于选择性降低HCP水平，而不会影响其他关键蛋白质质量属性。

4.3生物反应器中的工艺参数

表2总结了CHO衍生的生物治疗药物生产过程中影响HCP谱的主要上游生物工艺参数及其控制策略。生物反应器工艺参数（如反应器类型、叶轮剪切力、培养基添加剂、pH值、温度、渗透压和溶解氧、培养持续时间和收获活力）都可能影响HCP概况。在这些因素中，发现收获时的细胞活力对HCP谱的影响最大。细胞内HCP释放到死细胞参与的培养基中，导致HCP水平显着增加。

表2.CHO衍生的生物治疗药物生产过程中影响HCP谱的主要上游生物工艺参数和控制策略总结

降低细胞培养温度也降低了HCCF中的多种HCP。已知分别有助于蛋白质聚集和降解的伴侣和蛋白酶显著减少。作者假设降低温度可以减少继发性坏死并改善细胞的顺势粘性适应。这有助于抑制凋亡细胞并减少损伤产物的HCP的释放。然而，考虑与mAb相互作用的HCP群体也很重要。正如Valente等人（2015年）的后续研究所示，轻度低温状况在蛋白A后产生的残余HCP高出3.6倍，这可能是由于HCP增加，与mAb的相互作用更强。HCP水平可能因具体情况而异，具体取决于收获前的天数（天数更容易测量，但更准确的指标是细胞活力）。具有较高细胞活力的早期收获可减少细胞破裂和细胞质HCP释放。然而，过早收获培养物也可能导致细胞对剪切更敏感，从而导致下游澄清步骤中HCP的生成增加。

可能需要进一步研究以整合上游和下游工艺，并在收获和收获后步骤中平衡高活力和HCP水平之间的权衡。一些生物制造商主要关注治疗滴度，而另一些生物制造商则更关注质量属性。对影响HCP谱和浓度的细胞过程的机制理解的改进有助于改进上游HCP的减少。

4.4通过收获澄清清除HCP

通过澄清生产HCCF可去除堵塞的颗粒物（例如细胞、细胞碎片、胶体、聚集体等），以提高下游技术的能力，并可能降低HCP和DNA等杂质的浓度。高密度细胞会随着时间的推移而缓慢沉降，因此使用采用人工重力的离心技术来更快地沉降较小尺寸的颗粒（沉淀的HCP、絮凝剂等）。然而，入口区域的高剪切力会裂解细胞并导致HCP水平升高。

MF-TFF（微过滤器切向流过滤）技术也被用于通过将颗粒保留在膜表面来澄清收获物。当mAb通过微米大小的膜孔时，很少有纳米大小的HCP被去除。MF-TFF运行期间的泵送可能会因流量限制而脱气，例如由于密封不良导致泵中的空气，或混合器和储罐出口中夹带气体，从而导致HCP增加。

利用正常流量过滤的深层过滤器可捕获颗粒并降低细胞培养液中的HCP水平。深层过滤器通常由纤维（例如纤维素、聚丙烯酸）和助滤剂（例如硅藻土、二氧化硅）的支撑层组成，以增加吸附表面积。树脂粘合剂可提高过滤介质的强度，并改变带电荷和疏水区域的表面特性。深层过滤器可作为具有笨重外壳的透镜状堆叠盘或集成的“pods”，以便于组装和改进密封。

使用深层过滤器去除HCP是通过尺寸排阻（对于大颗粒）和吸附（静电、疏水、氢键）的组合来实现的，但HCP组成的差异会导致不同的行为。与带负电荷的HCP相比，具有净正电荷的HCP在带负电荷的深层过滤材料上表现出更高的保留率。使用电导率较高的缓冲液时，保留性会降低，因为盐离子可以在过滤器和蛋白质电荷之间进行筛选。如果pI靠近mAb分子，则可能难以分离HCP的静电去除。观察到疏水吸附，因为当使用乙醇等有机溶剂冲洗深层过滤介质时，会释放吸附的HCP。虽然有人认为疏水性和静电相互作用在HCP去除中起着重要作用，但助滤剂的密度和树脂粘合剂的均匀性也可能产生影响。由于更密集的填充和不同的吸附方向，发现细长的HCP在助滤剂中保留得更好。在同一项研究中，均匀分布在深层过滤器上的带正电荷的树脂粘合剂允许大多数带负电荷的HCP结合。然而，如果助滤剂在滤材上的分布不太均匀，它也允许深层滤光片中带负电的区域与带正电的HCP相互作用。

在本文研究者的汇总分析中，在几项研究中评估了深层过滤器HCP结合载量，并使用吸附模型预测HCP清除率（图2）。尽管预测的HCP对数清除率趋势随着饲料HCP的增加而下降，但它并不影响预测的滤膜结合HCP的增加，这表明随着饲料HCP水平的增加，深层过滤器的HCP清除率通常受到可用滤区的限制。饲料中HCP水平高是由于高细胞密度培养物和高mAb表达率造成的。这可能导致>1m的非常大的深度过滤区域2/100L进料。

图2：预测不同深度过滤器和初始进料水平的HCP对数清除率和结合HCP水平

使用絮凝或沉淀的颗粒聚集可以改善沉降、减少过滤面积并去除HCP。酸化是生物制造中的经典过程，包括CHO细胞培养物的沉淀，它利用了HCP和mAb的pI特性。对于pI为4.0–6.5的HCP，使用弱酸降低进料流的pH值可以沉淀HCP，同时保持目标mAb的溶解度。辛酸（CA）是一种含有8个碳原子的脂肪酸，因此也称为辛酸。已经探索了CA沉淀来诱导杂质絮凝，从而减少后续深度和生物负荷减少过滤器的表面积。CA显示通过增强HCP沉淀去除>90%的HCP。这是由于CA在水中的溶解度弱，导致其沉淀。CA在低pH值（4.5–5.5）下的疏水性允许具有酸性pI范围的HCP共沉淀，从而导致更高的HCP去除率。

不带电荷的聚合物，如聚乙二醇（PEG），经常用于通过体积排阻机制沉淀蛋白质；PEG占据了溶液的很大一部分，从而将蛋白质挤压成更小的体积，在那里它们超过了其溶解度极限并沉淀。然而，PEG的有限尺寸选择性也可能导致靶蛋白沉淀。为了克服这个问题，水性两相系统（ATPS）已应用于各种工艺。ATPS由不带电荷的聚合物和盐聚合的混合物组成，产生两个水相，分别包含目标蛋白质和杂质。

阳离子聚合物，如聚二烯丙基二甲基氯化铵（pDADMAC）和聚胺，经常用作絮凝剂与分级深层过滤器结合使用。对于带净负电荷的HCP，pDADMAC可与HCP结合，导致其絮凝，使目标mAb蛋白可溶，从而获得90%的收获物回收率，同时减少HCP。

在下游纯化中，HCP沉淀后进行深度过滤可能更便宜，但与其他方法相比，选择性通常较低，导致纯化效果不佳和/或mAb产量不佳。冷乙醇沉淀（例如Cohn分级分离）历来用于工业规模的血浆蛋白纯化，其中成本重要，选择性较低。聚乙二醇（PEG）通常用于纯化蛋白质，并且更昂贵。在酸性pH值下从蛋白A中洗脱mAb后，在此阶段应用CA步骤已被证明可有效去除HCP，且LRV为2LRV（对数10还原值）清除率在pH范围4.5–5.5。不同沉淀剂（CEP、PEG、CA和CaCl2）导致HCP去除率与蛋白A亲和层析相当。在絮凝溶液中添加PEG有助于絮凝聚集并加速絮凝物沉降，从而减少或消除上清液的深层过滤。絮凝剂洗涤步骤可提高产量。由于不同mAb治疗药物及其表达之间的差异，似乎没有一种方法适用于所有治疗药物。相反，将几种方法开发为工具箱中的工具会很有用，这些方法可以根据具体情况使用，因为它们最有效。

【NO.5】下游生物工艺中HCP的控制

5.1蛋白A色谱和HCP清除

蛋白A层析广泛用作结合和洗脱模式下的捕获步骤，通过去除工艺和产品相关杂质来纯化mAb。由于其对IgGFc区域的高度特异性，蛋白A层析可在下游加工步骤中提供高HCP去除率，因为大多数HCP在流通组分中被去除。然而，由于非特异性结合和/或mAb-HCP相互作用，mAb洗脱馏分中可能会出现高HCP水平（范围为2000至>10,000ppm，图3）。QbD案例研究工作组将洗脱池中的HCP描述为5575至9893ppm（~0.9LRV），具体取决于mAb载样量（10–50mg/mL）和洗脱pH值（3.2–3.9）的关键参数。

图3：与标准洗涤相比，增强洗涤在去除HCP方面的有效性

蛋白A残留HCP包括与填料结合的HCP或吸附的mAb，这些HCP在洗脱步骤中与mAb一起释放。收获材料中HCP的pI分布广泛，其中大多数是酸性的。在已获批的mAb产品中鉴定出的HCP也反映了类似的广泛pI。然而，在mAb产品中最常观察到的HCP是碱性pI。许多可能的原因都可能导致共洗脱。收获物中染色质的存在会强烈影响这种HCP共洗脱。使用阴离子交换介质进行预过滤以去除染色质可降低蛋白A洗脱液中HCP的水平。关于与mAb的非特异性关联，一小部分mAb形成具有高电荷-电荷相互作用的瞬时簇。这种显著增加的净正电荷数量被认为是带负电荷的HCP共洗脱的原因。在结合步骤后，可以使用赋形剂引入洗涤步骤，以破坏HCP结合并控制pH值>4.5以保持吸附的mAb。pH值为8–10的洗涤溶液将高于大多数mAb和HCP的pI，导致它们都带正电并相互排斥，同时保持mAb完好无损。

洗涤缓冲液赋形剂（表3）可以通过破坏HCP和mAb或底物之间的吸引力来减少结合的HCP。盐（例如氯化钠）会破坏静电结合。去污剂（例如TritonX-100）和溶剂（例如丙二醇）会破坏疏水结合。将高pH值与盐和辛酸盐相结合可提高HCP清除率。通常添加精氨酸以松弛静电键、疏水键和氢键，同时稳定折叠的蛋白质以减少聚集。添加PEG4000可产生更尖锐的洗脱峰，从而降低HCP水平和洗脱池。与标准洗涤液（2LRV）相比，包含添加剂或赋形剂的增强型洗涤剂显示出HCP去除率（超过5LRV）的改善，如图3所示。有趣的是，在强化工艺中，使用多个蛋白A柱并以高结合载量循环时，HCP清除率几乎相同。然而，额外的色谱精纯步骤用于为HCP去除提供强大的纯化平台。

表3.用于蛋白A色谱的中间洗涤添加剂被证明对HCP清除有效

5.2用于去除HCP的精纯色谱和吸附剂

在蛋白A步骤之后，将mAb保持在低pH值下以进行逆转录病毒灭活，然后中和用于后续工艺。中和步骤通常与HCP沉淀有关，需要随后的深度过滤以进行澄清和去除HCP。HCP去除机制与收获的机制相同，即使在低HCP浓度下，清除性能也与色谱相似（图4）。

图4：下游精纯步骤中HCP清除技术与进料HCP浓度的函数关系比较

然后，使用以不同模式（结合和洗脱、流穿、弱分配）运行并使用各种结合配体的各种色谱基质（树脂、膜）精纯色谱步骤去除剩余的HCP。这些已用于各种序列（表4），商业mAb生产最常见的步骤顺序如下：深层过滤–蛋白A–病毒灭活–阳离子交换色谱–阴离子交换色谱–病毒过滤–超滤/渗滤。吸附步骤采用不同的机制来去除HCP。

表4.集成流程的HCP许可

对于流通模式下带正电荷的阴离子交换（AEX）色谱柱结合，在低于mAb pI的pH值（通常为>7.5）下作时，mAb带正电荷且未结合，而pI较低的HCP将带负电荷并结合。电导率水平也需要保持在较低水平，以保持较高的静电结合强度并避免盐的电荷钝化。精纯步骤进料中的低HCP负载不需要AEX填料或膜的高结合载量（图4）。HCP进料浓度的广泛范围也反映了纯化过程中的不同位置。最后一步，QbD案例研究工作组将流通液中的HCP表征为7至26ppm（~0.5LRV），具体取决于负载电导率（1.6–5.6mS/cm）和pH值（7.2–7.8）的关键参数。在最后一步中，HCP的行为也更像单个物种，保持为单个峰，而不会分裂成以不同速度穿过吸附床的不同峰。AEX导致HCP进料浓度约为10时，HCP清除率为2-3LRV3ppm;低于102ppm，获得的LRV小于1（图4）。

AEX膜层析特别适用于这种需要短停留时间的应用。这导致尺寸显著减小，并促进了一次性操作。具有高密度结合位点和快速传质的各种膜可将HCP降低85-93%，膜载量为2-14kgmAb/L，停留时间仅为2-6秒。整体和填充纤维等新规格尚未广泛用于mAb精纯。

阳离子交换（CEX）色谱通常用于以结合和洗脱模式去除mAb中的聚集体、电荷异构体和HCP。在pH值为6.0的条件下上样可使高pI HCP带负电荷，并在流出馏分中保持未结合状态。通常，CEX洗脱步骤的pH值、盐浓度和梯度长度针对聚集体去除进行了优化，但这也会影响HCP的去除。

饲料HCP水平为104到10，CEX清除约2-3个LRV，其中HCP主要存在于流出部分（图4）。当使用CEX作为蛋白A捕获后的第一步时，QbD案例研究工作组将洗脱中的HCP表征为16至91ppm（~2.2LRV），具体取决于上样量的关键参数（10–30mg mAb/mL）和洗脱电导率（3–7mS/cm）。这与没有洗涤步骤的蛋白A的HCP清除率相当。进料浓度低于10时的CEX清除率高于AEX报告的值。填料和膜层析显示HCP LRV性能无显著差异。

疏水作用色谱（HIC）可显著降低HCP水平，混合模式色谱也是如此，它采用疏水和离子交换相互作用。在结合和洗脱精纯色谱的情况下，使用添加剂（例如精氨酸、尿素、乙二醇、己二醇、辛酸钠等）实施中间洗涤步骤已被证明可以提高HCP清除率，类似于蛋白A捕获色谱。HIC的流动相条件可以设置为不结合目标蛋白，从而允许在去除结合的HCP的同时进行流通分离。混合模式或多模式色谱（MMC）在同一配体中采用新型配体（例如巯基、伯胺、羟基）或带电（阳性或阴性）和疏水性（例如烷烃、苯基）基团的组合进行多点相互作用（例如羟基磷灰石）。这些配体可以提高结合选择性（纯度与产量权衡）和结合溶液耐盐性。有些人甚至使用MMC来替代蛋白A。然而，多点相互作用需要使用DoE和高通量筛选（HTS）方法进行广泛筛选，以找到上样、结合、洗脱缓冲液pH值和电导率的“最佳位置”以进行作。更高的成本和更长的工艺开发往往使MMC成为次要选择，用于传统填料无法满足性能目标的问题治疗。

优先保留强结合杂质，取代弱结合mAb和杂质，显著提高填料利用率。CEX填料上mAb产物和低流行率HCP之间的强化置换可实现HCP的选择性分离。前层析利用这种杂质置换，允许在CEX中进行流通式分离，从而有助于下游纯化的工艺集成和连续处理。这主要针对聚集体的去除，但也有助于去除HCP。

活性炭（AC）填充柱采用具有高表面积的多孔结构，通过非共价相互作用实现HCP的吸附结合。使用AC可有效去除低分子量蛋白质杂质。然而，很难对活性炭的吸附机制做出明确的结论，因为这也取决于蛋白质的电荷、形状和疏水性。当pH值处于蛋白质的pI时，AC具有最大的蛋白质结合能力，此时蛋白质电荷和静电力最小，疏水相互作用占主导地位。观察到对负载、盐度和pH值敏感的重组酶降低了3LRV。据报道，低电导率下，AC处理性能也会得到改善。鉴于HCP的多种特性，可以应用基于pH值和电导率的DoE方法。

AC对HCPLRV的清除率与AEX相当（图4）。已在澄清后无蛋白A和蛋白A后在CEX或AEX之前进行了评估。对于使用酸沉淀、洗滤以降低电导率和AC的纯化序列，强大的HCP去除优于蛋白A。通过流通式AC去除HCP与AEX正交，即去除不同的HCP组分。该AC步骤可强化后续阴离子交换柱，以减少蛋白A后精纯步骤中的杂质负荷。

【NO.6】在集成和连续加工中生成和去除HCP

使用灌流的连续生物反应器作正在积极研究中，并越来越多地被用作提高生物反应器生产率、降低成本和改善产品质量的方法。一项研究比较了12K补料分批（FB）、2L稳态灌注（SS）和2L非稳态（NSS）灌注生物反应器中产生mAb的CHO细胞中HCCF中的HCP水平。FB持续11天，第7天的最大活菌密度为15.6×106细胞/mL，第11天活力为25%，滴度为1.5g/L。连续灌流培养使用MF-TFF进行收获。交替切向流（ATF）是指样品使用隔膜交替流过TFF膜表面，用于控制膜污染、保持mAb传递并减少剪切损伤。SS每天使用1个血管容积（vvd），第3-14天增加到2vvd，维持40×106活细胞/mL（使用出血流），整个细胞活力为95%，滴度为7.5g/L。NSS使用1vvd，3种饲料浓缩物（无渗漏）增加到0.5vvd，并达到221.7×106的峰值第7天为活细胞/mL，到第11天降至37%，滴度为21g/L。HCCF2-D凝胶显示出相当的斑点模式和mAb斑点强度，SS的总体HCP水平降低。ELISA发现的HCCF水平为4.5×105FB的ppm，5.8–7.4×104SS为ppm，×10为2.1–6.35LC-MS对NSS的ppm值，归因于SS中裂解的减少。灌注还降低了HCCF中HCP组分的数量，从FB或NSS中的1310到1903个降低到SS中的165-347个，如高分辨率LC-MS所示。在补料分批中，大多数杂质在培养过程中积累，并在一次收获后被下游去除。连续灌流系统可交换细胞培养基并防止杂质积累。

蛋白A洗脱液中的HCP水平为FB为263ppm，SS为63-86ppm，NSS为115-123ppm。SS的低水平表明开发和验证其他精纯步骤的工作可能会减少。FB中不同HCP成分的数量进一步减少到319个，SS中为16-27个，NSS中为14-37个。脂肪酶水平也降低。SS或NSS中的较低水平归因于由于带电的mAb变体数量较少和酸性HCP减少而导致的与mAb的结合降低。

连续灌流和补料分批工艺的比较（表4）显示了相当的最终HCP水平和LRV。连续下游步骤采用深层过滤器循环，多柱循环（MC）进行结合和洗脱作，以及流通式吸附去除HCP。强化补料分批处理的高细胞质量、更高的HCP和高滴度可能会影响下游杂质的连续清除。由于色谱柱通常根据产品的质量进行加载，因此要实现更高的比生产率，需要最大限度地提高产品产量和减少杂质。在一个报告的案例中，使用高种子序列的上游补料分批培养物与连续下游加工相结合，强化工艺中的HCP水平被可靠地控制在低于传统工艺的水平;滴度也得到了显著提高。在由高密度灌注细胞培养和直接耦合连续捕获步骤组成的集成连续处理中观察到的HCP与在30天内的整个连续收获捕获期间使用分批柱操作的HCP相当。在30天的工艺中连续灌流50L并进行连续下游处理，产生的宿主细胞蛋白与500L补料分批常规14天工艺相当。在连续集成工艺中，HCP量不会保留在灌流反应器的细胞保留装置上，从而导致生物反应器和收获物之间的水平相同。随后，HCP的主要减少发生在蛋白A层析过程中。然后通过精纯色谱去除剩余的HCP。

众所周知，蛋白A层析是mAb加工平台的核心步骤，但在连续加工中，它仍然存在成本和稳定性以及腐蚀性稳定性的瓶颈。已探索将非蛋白-A连续下游处理作为替代方案，包括沉淀、深度过滤和精纯层析的组合。已报告可接受的HCP限值，且商品质量属性一致。

流通模式也是与单元操作的简单连接，用于在连续下游加工中进行强化抛光。集成互联过程的持续运行需要对过程有很好的了解，以确保可以从设计窗口正确控制它们（例如，AC-AEX-CEX的集成）。事实上，在连续的下游工艺中，HCP突破是通过流通色谱法检测到的。稳态运行的内在一致性提供了高且恒定的产品质量。在比较间歇和连续工艺时，HCP清除结果几乎相同。

在一些集成工艺中，已采用单通道切向流过滤（SPTFF）作为在线浓缩步骤。使用SPTFF进行在线稀释可以调节pH值和电导率等条件，以耦合装置操作。SPTFF的实施通过减少收获量展示了“设施去瓶颈”的优势。然而，据报道，需要使用预处理（例如吸附过滤器）去除HCP，才能使SPTFF保持稳定。在下游应用中，有人建议使用SPTFF来改善痕量浓度精制中的HCP色谱柱结合。例如，在AEX之前的在线进料浓度（mAb和HCP含量）会导致HCP在较低负载下运行时与AEX填料的高结合。据报道，这种集成工艺可减小色谱柱尺寸、缓冲液体积和槽体积要求。

【NO.7】HCP清除：未来的技术

产品质量以及监测和控制HCP治疗安全性、有效性和纯度的监管驱动因素仍将在未来（第2节）。在下游难以去除的HCP，尤其是“高风险”HCP，必须继续得到解决。我们预计未来的实施将是历史趋势的自然延伸，渐进式技术变化和新技术将发挥关键作用。可以预期检测性能的改进、HCP表达的降低、HCP清除率的提高以及由于新的治疗方式和表达系统而发生的变化。这将导致更轻松、更广泛地实施、更轻松的验证、更轻松、更快速的使用以及更低的成本。

如第3节所述，检测的改进应减轻人们对HCP检测可能无法拾取小浓度的高免疫原性分子的担忧，这些分子通过纯化过程并进入最终产品。GC-MS方法超越了免疫原性检测，可识别HCP的分子成分。随着质谱和拉曼技术的改进，通过进一步缩小尺寸以允许在生产车间实施，同时还提供更准确的检测，它们可用于HCP的过程监测和可能的产品放行。这些目前被用于中试作，以描述和优化流程。用于PAT中的过程监测和控制可以在制造过程中实现更好的产量/纯度/成本权衡，例如生物反应器作、吸附剂洗脱液馏分的混合或透明体积的设置。实施更多测量需要相关的作限制和纠正措施。这将限制GMP对有价值的关键功能的使用。改进的分析有助于改进工艺，以降低纯化治疗产物中的HCP水平和变异性。在制造中实施质量分析可能需要对报告和校准进行一些组织更改。

新型mAb模式，例如抗体-药物偶联物（ADC），显示出显着增加的效力，因此治疗剂量可以小得多。这减少了HCP的负荷和任何随之而来的免疫原性反应。在mAb疫苗生产的情况下，对疫苗的免疫反应是理想的结果。佐剂用于增强这种免疫反应。在这种情况下，HCP的减少可能会导致治疗效果不佳。

如第5节和表2所述，生物反应器的变化（例如灌流操作、更高的细胞密度和生长培养基组成）也会影响HCP水平和组成。作为本综述的一般指南，较高的细胞密度似乎会导致CCS中更高的治疗性mAb和HCP表达，与约106ppmHCP的比例大致相同（图2和表4）。用更小尺寸的化学成分确定的易于分离的成分不断取代动物源性生长培养基和合成蛋白质成分，将减少蛋白质污染物，提高收获的一致性和安全性，并降低成本。利用氨基酸和酶的无细胞合成正在成为一种生产高达mAb大小的蛋白质的方法，其中需要表征的不同杂质群。

基因组编辑技术（如CRISPR）的准确性和易用性的提高可以促进有问题的HCP成分表达的缺失或“敲除”。这可能涉及与对细胞生长、细胞稳定性、产物表达和翻译后修饰至关重要的HCP组分进行权衡。mAb候选抗体也可以进行工程设计和筛选，以确保稳定性和有限的HCP结合。

对于mAb，HCP清除主要发生在蛋白A捕获步骤中，有助于从纯化和精纯色谱步骤、TFF和深层过滤器中去除（第5节）。尽管可能会出现特殊问题的情况，但该模板可为大多数mAb提供稳定的HCP清除率。通过实施洗涤步骤（减少与mAb结合的HCP）和新型吸附剂（如混合模式）的实施，这些步骤的清除率将得到改善，这些步骤使用多种相互作用（例如，在低溶解度、低pI、双特异性、融合产物、ADC的情况下）清除更多有问题的HCP。在某些情况下，使用双盐/pH梯度可能会提高性能。

一种广泛适用的结合HCP的流通式多模式吸附剂将是一种有用的产品，但其开发受到HCP的多样性和治疗性表面结合特性的挑战。一种可能性是筛选配体文库（例如，六聚体氨基酸配体）以识别和固定与“高风险”HCP结合的配体集合。这将在一系列pH值和电导率值范围内提供稳健的清除步骤，用于比当前方法需要更少验证和工艺开发的加工模板。

由于没有对已安装的深层过滤器进行流速分布评估，因此在大型组件中使用它们来色谱去除HCP可能会带来验证挑战。一些深层过滤器在运输过程中更脆弱且对开裂敏感。已安装的光栅过滤器上的密封不良表明早期浊度突破。浊度的降低可以用作衡量制造系统完整性的指标。使用完整性测试将有助于验证澄清中1-2LRV的HCP去除声明。带有SPTFF的流通式吸附器（CEX树脂、增强型AEX膜）以更易于使用的形式提供额外的间隙。连续处理（第6部分）将受益于更快速的在线分析，但也可能在离线产品池测试的情况下进行。一些生物制造商已经实施了具有部分产物结合（例如弱分配）的电泳色谱柱，以减少色谱柱数量而不增加产品中的HCP。

TFF尚未被列为有效的HCP去除技术。它已用于浓缩收获和澄清的细胞培养液，并去除低分子量培养基成分。TFF是一种基于大小的分色。HCP具有许多大小相同或大于mAb的组分，这意味着其中许多组分可以在此步骤中与mAb共纯化。需要添加组合函数。在特定情况下，使用带电超滤膜进行更多纯化已显示出一些前景，但由于HCCF中的组分种类繁多，它们对于工艺模板来说不够稳定。

除了新颖的制造技术外，改进的按比例缩小测试设备、系统和方法还可以提供更快、更简单的工艺开发、实施和特性验证。这些并不总是需要线性缩放，前提是它们可以预测制造秤性能。可以针对不同的单元作开发预测HCP清除率和mAb产量的数学模型。这些可能涉及既定的物理定律和经验近似值。模型可用于降低数据要求并更准确地预测设计空间。这可以节省时间、原料和检测要求。这些模型有时被称为用于过程仿真的数字孪生，或用于推断未测量值的软传感器。在计算机上进行过程模拟以进行优化比进行实验研究更容易。必须注意验证模型，而不是外推实证模型。在许多情况下，建模还可以提高对当前技术的理解，从而实现显著改进。

【NO.8】总结

本综述全面介绍了整个mAb生产过程中的HCP，并描述了当前的装置操作及其组合，从而提供了稳健的HCP控制和清除方法（表5）。由于产品产量和HCP去除之间的权衡，仍然需要通过多单元操作的整体方法。清除率主要依赖于多个层析步骤（即蛋白A、CEX、AEX），这些步骤已使用多孔按比例缩小测试系统在流通或上样、洗涤和洗脱条件下进行了优化。该过程是输送4–5LRV，从典型的生物反应器水平106ppm降至最终产品中1–100ppm的典型水平，受性能变化的影响。蛋白A捕获步骤中的HCP清除率约为2-3个对数级，并且至少需要两个进一步的后续去除过程。在流通式精纯中去除HCP仍然需要战略性的工艺组合，因为减少HCP对数的性能会随着进料HCP浓度的降低而降低。

表5.技术摘要

固定工艺流程的主要挑战是不同mAb的稳定性和去除“高风险”HCP。如果由于产品稳定性导致HCP去除条件有限，HCP-mAb由于结合导致共纯化，或阻止HCP靶标得到满足的其他因素，那么工具箱中可用的更多技术和技巧来处理出现的各种情况是有用的。

尽管澄清可以提供额外的清除率，但大多数生物制造商并未声称澄清是可靠的HCP去除步骤。此处建议进行深层过滤器鉴定测试，以方便索赔。包含低pH值絮凝步骤需要对工艺进行少量修改，并且可以与生物反应器上的控制充分一致，以便进行验证。使用其他技术可能需要更广泛的工艺开发来表征其作。实施可能会受到限制。

随着生物反应器操作的改进，HCP水平已显著降低。从长远来看，利用灌流、新生长培养基和基因工程的未来改进可能会继续提供改进。即使在连续生产等先进生物工艺中，也获得了与历史上相同的HCP清除率。

虽然生物制造商已经确定了工艺痛点并采用了其他行业的技术（例如TFF、深层过滤），但供应商已经为该行业开发和供应了新产品。这些进步可以通过流程需求的沟通和新技术的采用而不断改进。

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