Life Metabolism丨戚世乾和王佳伟课题组解析人源MON1A-CCZ1和RAB7A三元复合体高分辨率三维结构

自噬（ Autophagy ）是一种通过包裹、降解细胞内损伤或多余组分来维持内环境稳态的重要过程。自噬的完成依赖一系列高度协调的膜动态事件，其中自噬体与溶酶体的融合是关键步骤。这一过程中，小 GTP 酶 RAB7A 作为核心调控因子，其 功能依赖于非活性状态（结合 GDP ）和活性状态（结合 GTP ）之间的循环转换，而这种转换需由 GEF （鸟苷酸交换因子）和 G AP （ G TP 酶激活蛋白）催化完成 。 在酵母中， MON1-CCZ1 复合体 已被证实是 Ypt7 （ RAB7 的酵母同源物）的特异性 GEF ，该复合体 在细胞内 的 定位和调控 机制 一直是结构与细胞生物学研究的热点。然而 ，在高等哺乳动物中， M ON1-CCZ1 复合体 如何 特异性 识别 RAB7A 、介导 GDP 释放并促进 GTP 结合的分子机制，迄今仍未完全阐明。这一关键科学问题的解答对于深入理解自噬调控网络具有重要的理论价值。

近日 ， 四川大学华西医院生物治疗全国重点实验室戚世乾课题组和清华大学生命科学学院 / 北京生物结构前沿研究中心王佳伟课题组合作， 在Life Metabolism发表 了 题为Cryo-EM structure of the humanMON1A-CCZ1-RAB7A complex provides insights into nucleotide exchange mechanism的 研究论文 ， 该研究通过冷冻电镜技术 首次解析了人源 MON1A-CCZ1 (HsMC1) 和 RAB7A N125I （无核苷酸突变）形成三元复合体的高分辨三维 结构 ，成功揭示了 HsMC1 与 RAB7A 相互作用 的关键 分子 界面及 其 构象变化， 并通过体外核苷酸交换实验验证了重要的 GEF 活性调控位点。 通过将 R AB7A N125I 与不同核苷酸结合状态下的 R AB7A 结构进行比较分析， 结果表明， HsMC1 通过诱导 RAB7A Switch I 、 Switch II 和 P-loop 区域发生构象变化， 促进 R AB7A 由 GDP 结合状态向 GTP 结合状态的转换。 值得注意的是， 该研究在哺乳动物中发现了 MON1A-CCZ1 可调控 RAB7A P-loop 的构象变化，对于深入解析 R AB GTP ase 的核苷酸交换机制提供了新的见解。

该团队通过在 Sf9 细胞中共表达 RAB7A N125I 突变体和 MON1A (98-652)-CCZ1 复合体，成功得到了分子量均一、蛋白性质良好的三元复合体（图1a）。 MON1A 和 CCZ1 各自包括三个 LD 结构域（ LD1-LD3 ） ， 并通过 LD1 和 LD3 形成异二聚体。 MON1A 和 C CZ1 中的 LD1 结构域分别介导了与 RAB7A 的相互作用（图1b）。

在 MON1A-CCZ1 结合下， RAB7A N125I 的 Switch I 、 Switch II 和 P-loop 都发生了构象变化。值得注意的是， P-loop 的构象变化在之前解析的 Chaetomium thermophilum （ Ct ） Y pt7 N125I 中尚未观察到（图1c）。此外，研究人员还检测了 R AB7A P- loop 中与 CCZ1 相互作用的 S17 残基在核苷酸交换中的功能，结果发现该位点突变后大大降低了 R AB7A 对 HsMC1 的 GEF 活性响应（图1d）。

总之， 研究团队解析了 HsMC1 与 RAB7A 与形成复合体的冷冻电镜结构，捕捉到了 R AB7A 的无核苷酸状态。生化实验证实了 HsMC1 调控 RAB7A 的关键氨基酸， HsMC1 通过与 RAB7A 的 Switch II （ R 69 、 R 79 ）和 P-loop （ S 17 ）相互作用，介导了 RAB7A 在核苷酸交换中的构象改变。 基于这些发现，本研究提出了 HsMC1 介导 RAB7A 的核苷酸交换机制模型（图1e）。 HsMC1 结合 RAB7A 后，诱导其 Switch I 、 Switch II 和 P - loop 发生构象变化，降低 R AB7A 对核苷酸的亲和力，从而促进后续的核苷酸置换过程。 Switch I 中的 K38 插入镁离子配位的位置，进而驱逐镁离子。 Switch I 中的 F33 、 Y37 和 I41 发生构象重排，与 MON1A 形成疏水相互作用。与此同时， P-loop 发生构象变化，向镁离子配位的位置靠近。这些构象重排协同作用，进一步削弱了 R AB7A 对核苷酸的亲和力。 Switch II 则转变为稳定的螺旋构象，有利于 R AB7A 与 GEF 的结合，并维持 G EF-RAB 复合体的稳定。在 HsMC1 介导核苷酸释放后， G T P 被加载， R AB7A 恢复到其活性构象。当 RAB7A 与 G TP 结合时， Switch I 与 P-loop 恢复原位，而 Switch II 则由螺旋状态转为较不稳定的构象。该过程最终激活 RAB7A ，使其能够结合并招募下游效应因子。

图1: MON1A-CCZ1-RAB7AN125I复合体结构及RAB7A核苷酸交换机制

四川大学生物治疗全国重点实验室戚世乾教授和清华大学生命科学学院 / 北京生物结构前沿研究中心王佳伟副教授为本文共同通讯作者。四川大学 2022 级硕士生李昕娜、清华大学 2021 级博士生李丹、四川大学华西医院唐丹副研究员为本文共同第一作者。电镜数据采集在国家蛋白质科学研究（北京）设施的冷冻电镜平台完成。

https://academic.oup.com/lifemeta/advance-article/doi/10.1093/lifemeta/loaf017/8149154

制版人：十一

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