噬菌体展示技术：蛋白质药物发现的 “魔法钥匙”

摘要：本文主要介绍了噬菌体展示技术在新型蛋白质药物发现中的应用。该技术是一种成熟的体外展示技术，通过将肽或抗体片段与噬菌体病毒颗粒上的衣壳蛋白融合，实现表型与基因型的直接关联，从而快速筛选出特异性结合目标抗原的生物分子。文章阐述了噬菌体展示技术在抗体、纳米抗体、替代支架和肽等药物发现中的应用，介绍了相关的筛选策略、下一代测序技术的作用，以及该技术在其他领域的应用实例，并对其未来发展进行了展望。

一、噬菌体展示技术概述

噬菌体展示技术是体外展示方法的一种，自 20 世纪 80 年代首次用于展示肽以来，不断发展，如今已广泛应用于治疗性生物活性分子的发现。该技术的核心是通过将肽或抗体片段与噬菌体病毒颗粒上的衣壳蛋白融合，使噬菌体能够展示这些生物分子，进而直接将表型与基因型联系起来，实现快速鉴定富集的生物分子群体，以靶向感兴趣的抗原（图 1）。

1.1 抗体的噬菌体展示

抗体片段在噬菌体上的展示主要有两种形式：噬菌体形式和噬菌粒形式。在噬菌体形式中，所有 pIII 蛋白分子都作为融合蛋白表达，每个噬菌体尖端展示 3 - 5 个拷贝，呈多价展示；而在噬菌粒系统中，大部分 pIII 来自辅助噬菌体，只有一小部分来自噬菌粒，平均每个噬菌体展示不到一个拷贝，呈现单价展示。单价展示有助于常规筛选高亲和力克隆，但野生型噬菌体背景较高。

M13 丝状噬菌体是常用的噬菌体载体，其感染表达 F 菌毛的大肠杆菌菌株，使得在实验室环境中仅需几周就能完成快速便捷的发现过程。噬菌粒载体系统则将抗体展示与噬菌体繁殖分离，具有更高的转化效率，适合构建大型文库，常用于展示抗体片段和替代支架，而噬菌体载体更适合展示肽（图 2）。

噬菌体展示技术在治疗性抗体发现中发挥了重要作用，已衍生出众多生物技术公司，如剑桥抗体技术公司等。目前，至少有 19 种基于噬菌体展示的单克隆抗体和纳米抗体已获批准，还有许多处于临床开发后期（表 1、表 2）。此外，该技术还可与核糖体展示、酵母展示等其他技术协同，以及与下一代测序（NGS）、流式细胞术等结合，提高筛选通量。

抗体库的构建是抗体发现的关键步骤，包括天然文库、免疫文库和合成文库等。天然文库从非免疫供体中获取，可分离出针对多种抗原的特异性抗体，但亲和力通常较低；免疫文库通过免疫动物或人类获得，针对特定目标富集；合成文库则利用 DNA 合成技术和生物信息学设计，能够更精准地控制抗体序列，提高抗体的亲和力和开发潜力（图 3）。

1.2 纳米抗体（VHH 片段）

纳米抗体（VHH 片段）是源自骆驼科动物天然重链抗体的最小抗原结合抗体生物制剂之一，具有体积小、溶解性高、稳定性强和组织穿透性好等特点，可用于构建双特异性、多特异性生物制剂，或与其他分子融合，在抗肿瘤和抗感染治疗中具有重要应用前景。

Caplacizumab 是首个获批的纳米抗体药物，用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜（TTP），通过抑制血管性血友病因子（VWF）与血小板的相互作用发挥作用。此外，还有多种基于纳米抗体的生物制剂处于临床开发阶段，如 gefurulimab、ozoralizumab 等，用于治疗免疫介导和自身免疫性疾病。

1.3 替代支架的噬菌体展示

除抗体和纳米抗体外，噬菌体展示技术还可用于展示多种替代支架，如基于人组织因子途径抑制剂 Kunitz 结构域的 ecallantide、基于 lipocalin 结构的 Anticalins®、基于葡萄球菌蛋白 A 的 Fc 结合域的 Affibodies® 等。这些替代支架在治疗和诊断领域展现出巨大潜力，部分已进入临床试验阶段或获批上市。

以基于10FN3结构域的 Monobodies 和 AdnectinsTM 为例，10FN3结构与抗体可变重链相似，通过噬菌体展示或 mRNA 展示技术，可筛选出针对特定靶点的高亲和力结合剂，如 lerodalcibep 用于治疗高胆固醇血症和心血管疾病。Anticalins® 通过对 lipocalin 结构的四个高变环进行组合设计，实现对目标抗原的特异性结合，可用于治疗多种疾病，并在体内成像和诊断方面具有应用价值。Affibodies® 基于葡萄球菌蛋白 A 的 Z 结构域，具有体积小、亲和力高的特点，可用于肿瘤诊断、成像和治疗，如 izokibep 用于治疗多种自身免疫性疾病。

1.4 肽的噬菌体展示

丝状噬菌体（如 M13）是肽展示的常用载体，肽通常与 pIII 或 pVIII 衣壳蛋白的 N 端融合，长度在 6 - 43 个氨基酸之间，可呈线性或环状。肽噬菌体展示文库可包含多达1010个个体肽序列，能筛选出针对多种蛋白质和非蛋白质靶点的特异性肽结合剂。

目前，已有两种源自噬菌体展示的肽药物获批上市，即 ecallantide 和 romiplostim，分别用于治疗遗传性血管性水肿（HAE）和免疫性血小板减少症（ITP）。此外，肽噬菌体展示还可用于疾病特异性表位鉴定、疫苗设计、药物靶向递送等多个领域，在药物发现过程中具有广泛的应用前景。

二、噬菌体筛选策略

噬菌体展示筛选过程的关键是通过生物淘选（biopanning）富集针对目标抗原的噬菌体克隆。通常使用初始过量的文库（约1010个噬菌体颗粒）与目标抗原孵育，抗原纯度对筛选成功至关重要，可使用肽、重组蛋白或过表达目标蛋白的细胞作为抗原来源（图 3）。

筛选策略包括固相筛选和液相筛选。固相筛选将抗原固定在塑料表面、ELISA 板孔或珠子上；液相筛选则将抗原生物素化，在溶液中与噬菌体结合后，通过链霉亲和素包被的磁珠捕获复合物。液相筛选常用于提高筛选严格性，以分离高亲和力结合剂。

经过与抗原孵育、洗涤去除非特异性噬菌体后，可通过多种方法洗脱结合的噬菌体，如改变 pH 值、酶消化或使用游离抗原竞争。洗脱后的噬菌体重新感染大肠杆菌进行扩增，通常经过 3 - 5 轮筛选，可富集目标特异性噬菌体结合剂。筛选过程中可采用多种策略，如针对特定属性（如慢解离速率、pH 敏感性）、特定表位、去除不需要的结合剂等进行筛选，还可用于抗体的结构引导亲和力成熟和人源化改造。

2.1 细胞表面筛选（On - cell selections）

细胞表面筛选是一种克服表达困难的膜蛋白受体筛选难题的策略。通过使用过表达膜蛋白的细胞作为抗原来源，在细胞环境中进行筛选，可模拟体内环境。例如，CellectSeq 技术通过原位细胞筛选富集目标特异性噬菌体抗体，结合 NGS 分析和计算机分析鉴定抗原特异性抗体；µCellect 技术则结合微流控技术，在高度严格的细胞混合物中快速去除非特异性结合剂，已成功筛选出针对 GPCR FZD7 的皮摩尔亲和力抗体。

2.2 体内筛选（In vivo selections）

体内筛选是一种新兴策略，通过将噬菌体文库注射到动物体内，利用细胞和器官靶向原理，筛选与特定组织结合的噬菌体抗体。该策略已在多种疾病模型中成功应用，如鉴定动脉粥样硬化相关生物标志物、糖尿病相关抗体、肿瘤特异性抗体，以及用于药物递送穿过血脑屏障等，为个性化医疗和拓展药物靶点提供了新途径。

三、下一代测序（NGS）在抗体发现中的作用

NGS 技术彻底改变了抗体发现的工作流程，通过对噬菌体抗体克隆进行大规模测序，能够快速鉴定富集的特异性抗体克隆，助力先导化合物的选择。NGS 不仅有助于原始 VH/VL 配对，还可通过对目标特异性克隆的 CDR DNA 测序数据进行深度挖掘，识别更多相关的 CDR 谱系，以及通过对噬菌体抗体克隆池的测序，鉴定抗体序列簇，从而检索到罕见的克隆。

NGS 具有速度快、成本低、劳动强度低等优势，可用于评估文库质量、分析重链种系使用变化、评估 CDR 多样性等。常用的 NGS 平台包括 Illumina 系统、Ion Torrent PMG 平台等，随着技术的发展，NGS 已能提供更长读长和更高准确性的测序。

四、噬菌体展示在抗体发现和治疗性分子生成中的其他应用

4.1 针对毒素和毒液的治疗

噬菌体展示技术可用于生成针对毒素和毒液的抗体，解决传统抗毒素治疗的局限性。传统抗毒素多为动物源性多克隆抗体，存在生产困难、成本高、供应短缺、批次间差异大、副作用多等问题。而通过噬菌体展示技术，可生成重组单克隆抗体、纳米抗体或替代支架，如针对黑曼巴蛇毒、志贺毒素、α - 眼镜蛇毒素等的中和抗体，以及用于治疗其他毒素中毒的抗体和替代支架，这些新型抗毒素具有稳定性高、生产成本低等优势，有望改善中毒治疗效果。

4.2 针对 T 细胞受体上 pHLA/MHC 呈递肽的治疗

Tebentafusp 是一种通过噬菌体展示技术生成的双特异性肽 - HLA 导向的 CD3 T 细胞衔接器，用于治疗葡萄膜黑色素瘤。它通过将修饰的人 TCR 与抗 CD3ε 单链抗体片段融合，能够特异性结合肿瘤细胞上的抗原，招募细胞毒性 T 淋巴细胞，杀伤肿瘤细胞。

4.3 疫苗开发中的表位鉴定

噬菌体展示在疫苗开发的表位鉴定中发挥重要作用。通过展示随机肽序列或基因片段，筛选患者或接种者血清，可鉴定病原体的表位，用于开发更有效的疫苗，同时还可用于生成传染病诊断检测方法。此外，噬菌体展示技术还可用于直接开发基于噬菌体的疫苗，但目前该疫苗形式尚未获批。

4.4 ORFeome 噬菌体展示

ORFeome 噬菌体展示是一种用于表位映射和鉴定的新技术，通过在噬菌体表面展示病原体基因组的开放阅读框（ORFs），能够独立于转录组或蛋白质组检测免疫原性蛋白，已应用于多种病原体的研究，如蜱、李斯特菌、钩端螺旋体、SARS - CoV - 2 等，有助于发现生物标志物、开发诊断检测和疫苗。

五、以 SARS-CoV-2 为例看噬菌体展示技术的应用

在应对 COVID - 19 大流行中，噬菌体展示技术在快速生成抗病毒单克隆抗体方面发挥了重要作用。通过从多种来源构建噬菌体展示文库，包括人天然抗体文库、康复患者免疫文库等，成功筛选出针对 SARS - CoV - 2 的中和抗体。这些抗体主要靶向刺突蛋白的 S1 亚基的受体结合域（RBD），也有部分靶向 NTD 和 S2 区域。

从人天然抗体文库中筛选出的中和抗体具有高效性，部分抗体已进入临床试验阶段。面对病毒变异导致的中和抗体效率降低问题，可通过噬菌体展示技术进行亲和力成熟改造，提高抗体的亲和力和中和能力，或采用针对更保守区域、使用抗体鸡尾酒或双特异性抗体等策略，对抗病毒逃逸。

六、结论与展望

噬菌体展示技术是一种成熟且强大的体外展示系统，在蛋白质药物发现中发挥着重要作用，通过与其他技术结合和创新策略的应用，不断拓展其在生物制剂发现和开发中的潜力。未来，随着人工智能、结构生物学、微流控技术等的不断发展，噬菌体展示技术有望在药物发现领域取得更多突破，为治疗性生物制剂的开发提供更有力的支持，同时在诊断、生物标志物发现和靶点鉴定等领域也将发挥更大的作用。

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