蛋白质工程改造酶热稳定性，在酿酒酵母中实现玉米黄质的高效合成

作为一种常见的的类胡萝卜素，玉米黄质不仅能赋予食物鲜艳的色泽，更因其具有强大的抗氧化性被广泛应用于化妆品和保健品领域，其也是高价值四萜化合物生物合成的前体，包括藏红花酸、虾青素和紫黄素。传统上，玉米黄质主要从玉米、水果和蔬菜中提取，但这些天然来源的产量有限，难以满足日益增长的市场需求，因此微生物发酵正逐渐成为玉米黄质生产的新方向。

玉米黄质的生物合成途径始于 β-胡萝卜素，并经过 β-胡萝卜素羟化酶 CrtZ 的催化，最终可转化为玉米黄质。

但这一过程面临一个关键瓶颈：负责玉米黄质合成的关键酶——β-胡萝卜素羟化酶 CrtZ 的热稳定性较差，导致发酵必须在低温（如 20 ℃）下进行。此前的研究表明，在酿酒酵母中，β-胡萝卜素的产量可以达到 79 mg/g DCW（细胞干重），而玉米黄质的最高产量却仅有 22.06 mg/g DCW，严重限制了工业化生产的效率和成本。

为了解决这一问题，近日，天津大学姚明东、肖文海研究团队在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上发表了一项题为“Engineered βCarotene Hydroxylase with Excellent Thermostability Promotes Zeaxanthin Production in Yeast”的突破性研究，研究人员通过蛋白质工程技术成功提高了 CrtZ 的热稳定性，最终在酵母中实现了玉米黄质的高效生产。

研究团队首先选择了一种来自欧文氏菌（Erwinia uredovora）的高效 β-胡萝卜素羟化酶 CrtZ 作为改造目标，随后采用了基于位置特异性打分矩阵（PSSM）的酶工程改造策略——即利用蛋白质序列进化信息来预测氨基酸位点保守性的工具，通过分析 CrtZ 及其同源蛋白的序列，筛选出能够提高酶稳定性的氨基酸突变位点。

首先，研究人员将 Eu CrtZ 野生型引入酿酒酵母菌株，以生产玉米黄质。在 20 ℃ 发酵后，玉米黄质的产量为 154.7 mg/L。在 30 ℃ 下，玉米黄质的产量也显著下降，仅为 70.8 mg/L。

利用 PSSM，研究人员在分析 CrtZ 家族的序列后成功锁定了 24 个潜在的“耐热改造位点”，并构建了相应的 β-胡萝卜素羟化酶突变体库。经过体外实验验证，他们发现 M83L 和 M73D 两个突变体在 30 ℃ 下的活性分别比野生型提高了 1.51 倍和 1.49 倍。其中，M83L 突变体的最适温度比野生型 CrtZ 提高了 20 ℃，达到了40 ℃。

在获得高性能的 CrtZ 突变体 M83L 后，研究团队将其引入酿酒酵母底盘细胞中，构建了玉米黄素生产菌株 ySMY2。与野生型菌株相比，ySMY2 在 30℃ 摇瓶发酵条件下的玉米黄素产量提高了 121.2%，达到 156.8mg/L，这一结果初步验证了 M83L 突变体在酵母中的有效性。

不仅如此，研究团队还通过分子动力学模拟进一步揭示了其热稳定性增强的机制。研究人员发现，M83L 突变在关键区域（如 E42-F48 和 W102-Y106 残基区域）的柔性显著降低，这使得整个分子结构更加紧凑稳定，为其在较高温度下保持活性提供了结构基础。

此外，为了进一步提高玉米黄素的产量，研究人员还对酵母细胞内的代谢系统进行了优化。考虑到 CrtZ 催化反应需要电子供体等辅因子的参与，他们引入了RFNR/FD3 电子传递体系，该系统能够有效改善细胞内的电子传递效率，为 CrtZ 的催化反应提供更充足的能量和辅因子。通过将 RFNR/FD3 系统与 M83L 突变体进行匹配，菌株 ySMY5 的玉米黄素产量显著提高了 46.2%，达到 229.3mg/L。通过补全营养缺陷型标记和增加M83L的拷贝数，最终菌株（ySMY7）的产量达到了 374.6 mg/L。

为了验证该菌株工业化生产玉米黄质的潜力，研究团队在 5 L 规模的发酵罐中利用 ySMY7 菌株进行了补料分批发酵。通过优化发酵条件，玉米黄质的产量最终达到了 814.6 mg/L，这是迄今为止在酿酒酵母中报道的最高产量。

总之，这一成果不仅证明了高温发酵生产玉米黄质的可行性，也验证通过 PSSM 策略优化关键酶的热稳定性和催化效率的可能性。未来或许这一策略还将为其他依赖 CrtZ 催化的高价值化合物（如紫黄质、藏红花酸和虾青素）的生产提供新思路。

参考文献：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.5c00653

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