《自然·通讯》南京大学王炜/曹毅/蒋青/薛斌团队：具有时空编程力学特性的水凝胶用于干细胞辅助骨再生

水凝胶广泛用于基于干细胞的组织再生，提供支持性环境，促进细胞存活、分化和与周围组织的整合。然而，设计用于再生骨骼等硬组织的水凝胶面临着重大挑战。

因此，南京大学王炜/曹毅/蒋青/薛斌等教授团队提出了一种具有时空编程力学特性的大孔水凝胶，用于干细胞驱动的骨再生。他们使用基于液-液相分离的软模板技术创建大孔结构，并通过刚性蛋白质纤维的界面自组装来增强孔壳。水凝胶的大孔结构提供了充足的空间来防止增殖过程中的接触抑制。刚性蛋白质纤维包被的孔壳为引导成骨分化和防止机械负荷提供持续的机械线索。在时间上，水凝胶表现出可调的降解速率，可以在一定程度上与新组织的沉积同步。通过整合局部机械异质性、大孔结构、表面化学和再生降解性，他们在兔子和猪模型中证明了这些干细胞封装的水凝胶的功效。

图1 壳硬化大孔水凝胶的设计图

壳硬化大孔水凝胶的设计如图1 所示。 水凝胶通过聚乙二醇（PEG）和葡聚糖之间的液-液相分离软模板技术形成大孔，同时通过界面自主装刚性溶菌酶纳米纤维形成稳定的外壳。 通过调节葡聚糖和PEG的浓度，可以控制液-液相分离，以PEG作为渗透相，葡聚糖形成非渗透液滴。葡聚糖相充当大孔形成的软模板。 此外， 研究人员 还通过将 丙烯 酸基团 修饰的溶菌酶纳米纤维共价连接到水凝胶基质上，并 引入 了环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-对氟苯丙氨酸-赖氨酸-丙烯酸酯（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys-acrylate）（丙烯酰化RGD）配体以促进细胞黏附。在蓝光（405 nm）照明下使用苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸锂（Lap）作为光引发剂共聚，形成具有壳硬化大孔结构的水凝胶。

1.主要研究结果

（1） 水凝胶结构

研究人员在硬壳化的大孔水凝胶（SP 水凝胶）和无壳大孔的水凝胶（NP 水凝胶）的前体中观察到纳米滴，而没有大孔的水凝胶（NN 水凝胶）中不存在纳米滴。与NP 水凝胶相比， SP 水凝胶的纳米滴表现出更均匀的直径，并且存在溶菌酶纳米纤维涂层，SP 水凝胶内的大孔被绿色壳包裹。 此外，大孔的直径（>50 μm）超过了细胞的典型大小（~5–15μm），因此 SP 水凝胶被认为非常适合细胞包埋和培养。

图2 壳硬化大孔水凝胶的结构表征

（2） 机械和降解性能

研究人员评估了带壳大孔和水凝胶基质在水性环境中的刚度，发现水凝胶中带壳大孔的杨氏模量远高于基质。此外，他们发现具有不同浓度和不同比例的交联剂可调节水凝胶的生物降解性。在评估体外降解研究中，带壳大孔的杨氏模量下降的速度比低弹性模量水凝胶（SP-low）基质要慢得多，在42天内略微下降了20%。表明即使基质发生显著软化，刚性纳米纤维壳可以为封装的细胞提供一致的机械特性。

图3 壳硬化大孔水凝胶的局部机械异质化和可调降解

（3） 保护细胞免受机械损伤

作者进一步研究溶菌酶纳米纤维素外壳是否可以在水凝胶上的强烈机械负载下保护大孔内的细胞免受机械损伤。他们将MC3T3-E1 细胞封装在水凝胶的带壳大孔中，并将其以不同的应变（0%，30%和60%）进行循环压缩。经过1500 次压缩和松弛循环后，在中度和过度压缩下，包埋在 SP-low水凝胶中的细胞活力分别比NN -low水凝胶高 10% 和 15%。产生的活性氧（ROS）比NN-low水凝胶中的细胞少49% 和42%。而SP高弹性模（SP-high）量水凝胶的细胞活力分别比 NN 高水凝胶（<4%）高9倍和7倍。这些结果表明，SP 水凝胶可以有效地保护包膜细胞在动态负载下免受过度的机械应力，而不会影响细胞增殖。

图4 在动态变形下保护壳硬化大孔水凝胶免受机械损伤

（4） 硬壳为骨分化提供一致的力学信号

作者接着又 使用 SP -low 、 NP -low 、 SP -high 和 NP -high 水凝胶作为模型系统，研究了壳硬化的 SP 水凝胶是否可以始终如一地提供机械线索来指导干细胞向成骨细胞分化。分子标记物（OCN 和 Runx2）的免疫染色显示NP -low 水凝胶中成骨分化相关基因没有上调， 表明低 弹性模量 水凝胶基质弹性不会诱导细胞分 化。 而SP-low水凝胶中观察到OCN 和Runx2 的显著上调，表明成骨细胞分化的开始。 这表明SP-low水凝胶的硬化大孔壳即使在基质刚度较低的情况下也能促进成骨分化。

图5由刚性壳的一致机械线索驱动的包膜细胞的骨分化

（5） 使用兔模型进行骨再生

随后，研究者们将封装兔骨间充质干细胞（rBMSC的 NN、NP 和 SP 水凝胶直接植入新西兰白兔股骨髁中新产生的骨缺损中。结果显示， SP-low水凝胶组骨缺损几乎完全被骨组织填充，并被连续的皮质骨覆盖。 相反,其他组显示明显的空洞或间歇性皮质骨。对照组在缺损区域内出现相当大的空洞，表明骨再生最差。 此外，SP-low水凝胶组骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N）表明水凝胶填充区有明显的成骨作用。组织学评估进一步证实了SP-low水凝胶具有较强的骨再生能力。

图6 在兔模型中使用 rBMSC 封装的壳硬化大孔水凝胶进行骨再生

（6）使用猪模型进行骨再生

研究者们进一步将研究扩展到猪模型,使用封装猪骨间充质干细胞（pBMSC）的水凝胶 。 与兔模型结果相似,包封 pBMSC的 SP-low水凝胶（SP-low-cell）组几乎完全修复了骨缺损,形成了连续的皮质骨和骨组织。 相反，在其他组中，尽管部分缺陷修复，但明显的空洞和损伤仍然存在。SP-low-cell水凝胶组在骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N）方面均显示出最高的值，而在骨小梁分离（Tb.Sp）方面则显示出最低的值。相比之下，未 包封 细胞的SP-low水凝胶组和包 封 细胞的 NP -low-水凝胶组（NP-low-cell）骨再生能力较差，突出了植入细胞和大孔壳在促进有效骨再生中的关键作用。 通过组织学评价进一步验证SP-low-cell水凝胶组骨再生增强。

图7 在猪模型中使用 pBMSC 封装的壳硬化大孔水凝胶进行骨再生

2. 结论

综上所述，研究者们成功研究出具有时空编程力学特性的大孔水凝胶，用于干细胞驱动的骨再生。利用蛋白质纤维的液-液相分离和界面超分子自组装，水凝胶的大孔结构提供了充足的空间来防止增殖过程中的接触抑制。刚性蛋白质纤维包被的孔壳为引导成骨分化和防止机械负荷提供持续的机械线索。在时间上，水凝胶表现出可调的降解速率，可以在一定程度上与新组织的沉积同步。通过整合局部机械异质性、大孔结构、表面化学和再生降解性，我们在兔子和猪模型中证明了这些干细胞封装的水凝胶的功效。这标志着在定制水凝胶的机械性能以进行干细胞辅助组织再生方面取得了重大进展。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-59016-6