药学1区 | 上中医曙光医院等揭示双夏汤抑制神经炎症减轻5×FAD小鼠睡眠障碍的机制研究

【写在前面】：本期推荐的是由上海中医药大学附属曙光医院等研究团队近期发表于Journal of Ethnopharmacology(IF4.8）的一篇文章，揭示基于转录组学与分子生物学技术探究双夏汤抑制神经炎症减轻5×FAD小鼠睡眠障碍的机制研究。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Shuangxia Decoction attenuates sleep disruption in 5×FAD mice through neuroinflammation inhibition: An integrative analysis of transcriptomic and molecular biology investigations

民族药理学相关性：阿尔茨海默病（AD）是一种以记忆和学习障碍为特征的神经退行性疾病。昼夜节律紊乱导致的睡眠障碍在AD患者中十分常见。由半夏（Pinellia ternata (Thunb.) Breit.）和夏枯草（Prunella vulgaris L.）组成的双夏汤（SXD）千百年来已被有效用于治疗睡眠障碍。然而，SXD通过昼夜节律相关途径治疗AD的机制尚未被深入探究。

研究目的：本研究旨在通过综合方法确定SXD在治疗AD方面的疗效、机制及活性成分。

材料与方法：我们对野生型（WT）小鼠进行慢性时差（CJL）处理，并监测其休息/活动情况，比较WT、CJL以及CJL + SXD各组小鼠的休息/活动周期。此外，我们通过行为学测试和硫黄素染色评估SXD对5×FAD小鼠认知功能和Aβ负荷的影响。通过转录组学和生物学实验验证揭示SXD的作用途径。利用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）、分子对接和细胞热位移实验（CESTA）对SXD的活性成分进行分析。

结果：本研究结果显示，CJL小鼠在SXD治疗后休息/活动周期迅速恢复。此外，SXD治疗减轻了5×FAD小鼠大脑中Aβ斑块的积累，从而保护了其认知行为和运动能力。而且，SXD显著增强了5×FAD小鼠海马CA1神经元的突触可塑性和树突可塑性。转录组学分析显示，5×FAD小鼠体内与神经炎症相关的通路上调。后续的热图分析显示，在SXD治疗后，5×FAD小鼠体内促炎因子（如Cd68、Trem2、IL-6、IL-1β、Cxc3r1、Tnf等）分泌减少，抗炎因子（如IL4、Ccl19、Ccl21a等）分泌增加。同时，SXD上调了BMAL1、CLOCK等参与昼夜节律的正向调控因子，下调了NR1D1等负向调控因子。此外，在5×FAD小鼠中，小胶质细胞呈现阿米巴样形态，细胞突起少，细胞体呈圆形，而同龄的SXD处理组小鼠的小胶质细胞则保持分枝状外观。本研究还确定了SXD的20种主要成分，并挑选出3-（3,4-二羟基苯基）乳酸、鼠尾草酚苷和冬青海楠素D，进一步与常用的昼夜节律靶点REV-ERBα（NR1D1）进行分子对接。其中，鼠尾草酚苷通过CESTA实验显示出与REV-ERBα的强结合能力。

结论：我们的研究结果表明，SXD可能通过特异性结合小胶质细胞中的REV-ERBα来激活BMAL1/CLOCK通路，从而抑制炎症因子的转录，有助于缓解神经炎症并阻止AD进展，从而挽救5×FAD小鼠的昼夜节律。我们的研究结果为在AD早期开发基于SXD的疗法提供了科学基础，在AD早期，睡眠中断先于认知能力下降，为临床试验提供了潜在的线索，以改善睡眠质量，从而延缓AD患者的神经退行性变。

【前言】

2019年，全球约有5500万人患有阿尔茨海默病（AD，一种进行性认知障碍），预计到2050年这一数字将增至1.39亿。这一增长将影响约5-8%的老年人口，给公共卫生带来重大挑战。AD的主要特征包括老年斑（也称为淀粉样β（Aβ）斑块）的形成，这是由于淀粉样前体蛋白（APP）的异常裂解，以及神经原纤维缠结的发展，这是由于tau蛋白的过度磷酸化。由于AD的病理生理学复杂多变，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物疗效有限。鉴于AD的不可逆性，在认知症状出现之前进行早期诊断和治疗至关重要。

睡眠障碍与AD发病机制之间的复杂双向关系已越来越受到关注。老年人的睡眠障碍可能是AD早期发病的信号，在前临床阶段影响多达60%的患者。与睡眠模式健康的人相比，睡眠障碍者患AD的风险高出1.55倍，认知能力下降的风险高出1.65倍。这些睡眠障碍往往在疾病早期出现，并随着AD的发展而恶化，可能作为AD晚期死亡率的重要预测因子。AD中常见的睡眠障碍包括白天过度嗜睡和夜间失眠，这主要归因于昼夜节律的破坏。5×FAD小鼠，一种广泛建立的小鼠模型，也表现出白天初始阶段2小时的相位延迟和峰值清醒期。

核心分子昼夜节律通过转录-翻译反馈回路发挥作用，涉及BMAL1/CLOCK、抑制蛋白PER和CRY以及核受体RORs和REV-ERBs（REV-ERBα和REV-ERBβ），它们调节BMAL1/CLOCK通路的激活或抑制。BMAL1在人类松果体中呈现节律性表达，但在前临床和临床AD患者中这一节律受到干扰。在5×FAD小鼠中也观察到BMAL1和CLOCK的异常表达，这表明昼夜节律的改变、Aβ病理和tau病理之间可能存在联系。因此，通过药物干预靶向与昼夜节律相关的蛋白质，可能有助于通过缓解睡眠障碍来实现AD的早期治疗。

最近的AD研究进展强调了神经炎症在介导睡眠-AD关系中的关键作用。小胶质细胞的过度激活与炎症介质一起，在神经炎症过程中起着关键作用。在中枢神经系统中，小胶质细胞占总细胞数的10-15%，作为免疫细胞和吞噬细胞发挥作用。小胶质细胞的突起具有高度动态性，其激活通常以形态学变化为特征，从高度分支（分枝状）阶段逐渐变为受刺激的阿米巴状，伴随表面分子的升高。小胶质细胞的激活，特别是通过NLRP3炎症小体途径，已被证明会破坏昼夜节律，同时促进Aβ沉积和突触功能障碍。先进的研究表明，小胶质细胞驱动淀粉样β蛋白病，并介导淀粉样β对tau蛋白病的影响。这种神经炎症级联反应形成了一个恶性循环，睡眠障碍加剧神经炎症，而神经炎症又恶化睡眠质量，加速神经退行性变。尽管对这一机制有所了解，但目前针对AD相关睡眠障碍的药物干预仍然有限，通常仅提供症状缓解，而未解决潜在的神经炎症过程，导致药物依赖。

中医药（TCM）含有多种天然化合物和活性成分，在治疗伴有睡眠障碍的AD方面具有良好的效果和较少的不良反应。根据中医药理论，AD伴有睡眠障碍的主要发病机制归因于“阴阳失衡”。双夏汤（SXD），由半夏（Pinellia ternata (Thunb.) Breit.）和夏枯草（Prunella vulgaris L.）组成，历史上被记载具有镇静作用。该方剂记录于《黄帝内经》中，此后在临床实践中被广泛使用。SXD被认为有助于身体能量的“阴阳平衡”，促进正常生理功能的恢复。从机制上讲，SXD通过增加下丘脑5-HT1A和5-HT2A受体，同时降低血清TNF-α水平来发挥治疗作用。SXD提取物还具有镇静作用。然而，SXD治疗是否靶向AD患者的昼夜节律相关轴尚未被研究。

本研究团队已构建了一个稳定的昼夜节律紊乱小鼠模型，并用于研究疾病进展。在本研究中，我们旨在研究SXD对昼夜节律相关蛋白的影响及其与神经炎症的潜在联系。首先，我们使用5×FAD小鼠，这是一种在AD前病理阶段表现出睡眠障碍的AD小鼠模型，并进行行为实验和Aβ染色，以分析SXD在治疗AD病理方面的作用。随后，我们进行了RNA-seq分析和实验验证，以阐明SXD在AD中的作用机制。最后，我们采用UPLC-Q-TOF-MS检测SXD在AD治疗中的潜在成分。我们的研究工作框架如图解摘要所示。通过系统研究SXD的多靶点机制，我们的研究加深了对中医药在AD治疗中的理解，并为睡眠、神经炎症和神经退行性变之间的复杂相互作用提供了新的见解。

【结果】

1、慢性时差（CJL）小鼠接受双夏汤（SXD）治疗后活动周期和幅度的快速恢复

我们构建了一种慢性时差（CJL）模型，观察双夏汤（SXD）对睡眠障碍的影响。小鼠重新暴露于标准光照条件下（LD），期间继续接受SXD（中剂量5克/千克）或水处理。

通过分析运动活动，我们证实CJL模型破坏了野生型（WT）小鼠的昼夜活动规律。SXD治疗后活动规律发生改变。此外，光照小鼠（LD）表现出约24小时的昼夜节律周期，而CJL小鼠在置于光照条件（LD）下4天后，其活动周期逐渐接近LD组，但波动范围更大。相反，CJL + SXD组在置于光照条件（LD）下仅1天后就迅速恢复了活动周期，到第3天时，其活动周期已非常接近LD组。

此外，CJL降低了小鼠的活动幅度，而SXD治疗恢复了降低的幅度。我们的研究表明，SXD在CJL后能够快速恢复周期和幅度，为中医药在治疗昼夜节律紊乱中的潜在应用提供了有力支持。

2、双夏汤（SXD）提高了5×FAD小鼠的认知功能

我们进一步利用几种行为测试，评估了不同剂量（2.5克/千克、5克/千克和7.5克/千克）的SXD对5×FAD小鼠学习和记忆能力的改善效果。在药物治疗3个月后，对每组小鼠进行了新物体识别（NOR）和水迷宫（WMW）测试。NOR是一种基于小鼠探索新物体的固有倾向的记忆和学习测试。通过识别指数（RI，计算公式为：新物体识别次数/总识别次数×100%）来评估它们对新奇性的识别。

结果显示，在1小时的识别过程中，5×FAD组的RI较WT组降低，而在5×FAD-SXD-M和5×FAD-SXD-H组中得到改善。然而，5×FAD-SXD-L组未见变化。此外，在24小时测试点，三组间未见显著差异。为了评估空间学习和记忆能力，我们对每组小鼠进行了标准的水迷宫（MWM）测试。

结果显示，在5×FAD组中，与WT组相比，寻找隐藏平台的逃脱潜伏期在第5天和第6天增加，平台移除后穿越平台的次数在第7天减少。而5×FAD-SXD-H组在第5天和第6天到达隐藏平台的逃脱潜伏期减少，第7天穿越平台的次数恢复。相比之下，5×FAD-SXD-L和5×FAD-SXD-M组未见显著变化。NOR和MWM测试结果表明，中高剂量的SXD可以显著改善学习记忆障碍，并逆转5×FAD小鼠在AD病程中的空间记忆衰退。

3、双夏汤（SXD）显著抑制大脑中Aβ的沉积

阿尔茨海默病（AD）患者及5×FAD小鼠大脑的一个关键病理特征是β-淀粉样蛋白（Aβ）的积累。如图3A-D所示，我们观察到5×FAD小鼠的大脑皮层和海马体（尤其是CA1和齿状回（DG）区域）中斑块面积分数（%）增加。相比之下，5×FAD-SXD-H和5×FAD-SXD-M小鼠与5×FAD小鼠相比，Aβ沉积显著减少，而5×FAD-SXD-L组未观察到显著变化。这些结果表明，SXD处理可能以浓度依赖性方式减少大脑皮层和海马体中的Aβ斑块积累。

4、双夏汤（SXD）显著增强了5×FAD小鼠CA1神经元的突触可塑性和树突可塑性

鉴于在高剂量SXD组中观察到了显著的治疗效果，后续研究将集中在这个剂量上。由于突触通常被认为是学习和记忆的细胞基础，我们采用高尔基染色法来评估SXD是否会影响突触可塑性，包括树突棘的密度以及突触的数量。SXD处理可以逆转5×FAD小鼠CA1区域锥体神经元复杂度和树突长度的减少（图4B和C）以及树突棘密度的降低（图4D和E）。此外，脑源性神经营养因子（BDNF）通过促进长期增强（LTP）和调节突触传递来增强突触可塑性，从而支持学习和记忆过程（朴和蒲，2013）。我们发现，在SXD处理后，5×FAD小鼠中BDNF水平的降低得到了逆转（图4F和G）。这些发现表明，SXD通过增强神经元突触可塑性，具有治疗阿尔茨海默病（AD）的潜力。

5、双夏汤（SXD）调节5×FAD小鼠的神经炎症相关通路及保留节律性基因表达

为了深入了解SXD在治疗阿尔茨海默病（AD）中的机制，我们对WT（野生型）、5×FAD和5×FAD-SXD-H组的小鼠脑组织进行了RNA测序分析。如图5A所示，三个组之间的差异表达基因（DGEs）的重叠部分以韦恩图的形式展示。对RNA测序数据进行主成分分析（PCA）显示，与WT组相比，5×FAD组的小鼠脑组织具有不同的转录组谱，而5×FAD-SXD组与WT组的转录组谱则更为接近（图5B）。通过热图展示了RNA测序数据的显著基因表达谱（图5C）。KEGG通路分析显示，在所有实验组中，炎症通路显著富集，例如细胞因子-细胞因子受体相互作用、NF-kappa B信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路等（图5D）。

有趣的是，结果主要富集了与神经炎症相关的通路，而与突触功能和神经元损伤相关的通路并未显著富集。随后的热图分析显示，在5×FAD小鼠中，经过SXD处理后，促炎因子的分泌（如Cd68、Trem2、IL-6、IL-1β、Cxc3r1、Tnf等）受到抑制，而抗炎因子的分泌（如IL4、Ccl19、Ccl21a等）则有所增加（图5E）。同时，SXD上调了与昼夜节律相关的正向调控因子如Bmal1和Clock，下调了负向调控因子如Nr1d1（图5F），这表明SXD对神经炎症的保护作用与调节5×FAD小鼠的昼夜节律有关。

我们通过qPCR、WB和ELISA进一步验证了RNA测序数据。结果显示，在5×FAD小鼠中，Bmal1和Clock的mRNA和蛋白质表达显著下调，而SXD则上调了它们的表达（图5H和I），这与我们之前的实验结果一致。此外，ELISA测试显示，SXD显著降低了海马体中促炎细胞因子IL-1β和IL-6的水平（图5I）。

6、SXD减少小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，抑制5×FAD小鼠的神经炎症反应

我们进一步评估了SXD处理后5×FAD小鼠中靠近Aβ斑块的小胶质细胞活化情况。此外，利用二维重建量化每个小胶质细胞的总分支长度和分支点数量，以确定小胶质细胞的状态。与野生型（WT）小鼠相比，5×FAD小鼠大脑中Iba1+小胶质细胞的数量增加了2-3倍，而经过SXD处理后，Iba1+小胶质细胞的数量有所减少。

在5×FAD小鼠中，围绕斑块（6E10+斑块）的小胶质细胞数量呈现出上升趋势，与WT小鼠相比，斑块相关Iba1+小胶质细胞水平有所增加（图6A和B）。SXD处理显著降低了斑块相关Iba1+小胶质细胞的数量（图6A和B）。此外，WT小鼠中的小胶质细胞呈现出高度分支的形态，而在5×FAD小鼠中，它们逐渐转变为具有回缩突起的变形虫状（图6A-E）。在5×FAD-SXD小鼠中，小胶质细胞的形态更接近于WT组观察到的形态，尽管它们在一定程度上仍然表现出肥大的迹象。此外，在5×FAD小鼠中，Aβ斑块聚集在M1型小胶质细胞周围，而在SXD处理后，随着小胶质细胞从M1型转变为M2型，Aβ斑块逐渐消失。这些结果表明，促炎性的M1型小胶质细胞可能与Aβ的产生有关，而抗炎性的M2型小胶质细胞可能促进Aβ的降解。

7、我们还进行了GFAP染色以识别星形胶质细胞，并观察到在5×FAD组的皮层、CA1和齿状回（DG）区域中星形胶质细胞显著活化，而在5×FAD-SXD组中则显著减弱（图7A-D）。上述结果表明，SXD对小胶质细胞的活化具有抑制作用，减少了M1型小胶质细胞的活化状态，同时促进了具有吞噬形态的M2型小胶质细胞的转化，并且也抑制了星形胶质细胞的活化，这表明SXD对神经炎症具有抑制作用。

8、双夏汤（SXD）的成分与小胶质细胞中的REV-ERBα强结合

为了探究SXD对小胶质细胞昼夜节律的影响，我们进行了免疫荧光（IF）共定位实验，检测了与小胶质细胞标记物Iba1相关的重要调节蛋白REV-ERBα和BMAL1，结果表明SXD抑制了REV-ERBα+，同时促进了BMAL1+小胶质细胞的表达（图8A），这表明SXD可能通过抑制昼夜节律的重要负调节因子REV-ERBα蛋白（通常用作药物靶点）来挽救AD小鼠的BMAL1/CLOCK通路，从而抑制小胶质细胞的炎症反应。

我们进一步利用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）分析了SXD的主要成分，以检测其成分是否能够与REV-ERBα蛋白结合。SXD的总离子流图（BPC）和混合对照物质在正负离子模式下主要化学成分的含量如图S1所示。我们筛选出了SXD的前20种关键成分（表1），并发现了三种最显著的成分：3-（3,4-二羟基苯基）乳酸、海南黄芩苷D和丹参素（Sal）（图8B）。

随后，我们对这些成分与目标蛋白REV-ERBα进行了分子对接，发现所有三种单体成分都与REV-ERBα紧密结合（图8C）。接着，我们对REV-ERBα和丹参素（Sal）进行了化学计量学温度变化分析（CETSA），丹参素是夏枯草的成分，可能在认知障碍（卢奇尼马斯等，2024）和睡眠障碍中发挥作用。随着温度升高，蛋白质与丹参素的结合活性明显比DMSO组更紧密（图8D）。

上述结果表明，SXD的成分可以与REV-ERBα结合以激活BMAL1/CLOCK转录。

SXD（四物汤）作为中医经典方剂，在临床治疗睡眠障碍方面具有显著疗效。为了进一步验证SXD在治疗阿尔茨海默病（AD）伴睡眠障碍动物模型中的治疗效果，我们构建了C57BL/6J（C57）小鼠模型和5×FAD小鼠模型，并对SXD进行处理。通过运动活动分析，我们发现SXD能快速恢复C57小鼠的周期和振幅，并通过新物体识别（NOR）和水迷宫（MWM）行为测试改善AD小鼠的认知能力。

为了进一步在病理水平上验证其有效性，我们使用硫黄素S（Thio-S）染色观察大脑区域中的Aβ沉积。我们研究中最显著的发现是，SXD处理后Aβ沉积显著减少，这伴随着行为测试中认知表现的改善。这一观察结果与最近研究表明中药具有抗淀粉样变性的研究结果一致。然而，我们的RNA测序分析揭示了一个意外的模式：虽然与突触功能和神经元损伤相关的通路并未显著富集，但我们观察到与神经炎症相关的通路发生了显著变化。这种明显的差异可能通过AD病理发生的时间动态来解释，其中神经炎症变化在疾病早期阶段先于明显的突触功能障碍。

小胶质细胞被认为具有与AD阶段相关的多种反应表型，这可能是促炎性或抗炎性的。在AD的初始阶段，抗炎性小胶质细胞，被分类为M2小胶质细胞，受到像IL-4这样的抗炎细胞因子的刺激。这种刺激导致诸如精氨酸酶-1等的分泌，其具有迁移到损伤位点并随后清除积累的Aβ的能力。然而，随着AD的进展，促炎性小胶质细胞（M1型）分泌像IL-1β这样的多种促炎因子，增强炎症级联反应，并最终导致神经元变性和持续的神经炎症。此外，TREM2与Iba1和CD68相关，这与在淀粉样相关小胶质细胞中TREM2的上调一致。我们随后的热图分析显示，在5×FAD小鼠中，SXD处理后促炎性小胶质细胞分泌物（Cd68、Trem2、IL-6、IL-1β、Ccl25、Ccl3、Cxc3r1、Tnf等）受到抑制，而抗炎性小胶质细胞分泌物（IL4、Ccl19、Ccl21a等）增加。我们进一步评估了我们研究中小胶质细胞形态的转变。我们发现SXD可以减少M1型（淀粉样相关）小胶质细胞的活化状态，同时促进吞噬形态M2型的转化。在斑块附近观察到的小胶质细胞Aβ吞噬作用的增加，加上促炎性细胞因子的下调，表明SXD促进了一种神经保护性小胶质细胞表型。小胶质细胞活化对Aβ斑块的空间分析进一步支持了SXD增强斑块清除并减轻神经毒性炎症的假设。

此外，昼夜节律在调节M1型小胶质细胞的活化中起着关键作用，从而通过其对免疫反应、吞噬活性和代谢功能的影响影响AD的进展。在AD小鼠模型中，昼夜节律的破坏增强了小胶质细胞的M1极化，导致神经炎症和AD的进展，而小胶质细胞的清除则减轻了节律破坏引起的认知缺陷。此外，昼夜节律基因的操纵已被发现影响小胶质细胞的功能。值得注意的是，像TNFα、IL-6和IL-1β这样的主要促炎细胞因子的昼夜表达模式表现出节律性波动。像REV-ERBα和BMAL1这样的蛋白质在M1小胶质细胞的转化和功能中起着调节作用。在AD小鼠中，小胶质细胞BMAL1/CLOCK通路的破坏触发NF-κB通路，导致促炎性基因的异常表达。抑制REV-ERBα减少M1型小胶质细胞的产生，增加M2样转化和吞噬作用，并进一步减少Aβ沉积。REV-ERBα激动剂SR9009被发现激活小胶质细胞并增加促炎性基因的表达，最终导致认知功能障碍。相比之下，用拮抗剂SR8278阻断REV-ERBα被证明促进BMAL1转录，并增加小胶质细胞对fAβ1-42的摄取。

综上所述，这些发现表明，针对REV-ERBs以促进生物昼夜节律的转录重塑，是早期AD治疗的有希望的策略。在我们的研究中，我们探讨了SXD在调节小胶质细胞昼夜节律中的具体作用。我们的结果表明，SXD在小胶质细胞中下调REV-ERBα并上调BMAL1的表达。

我们进行了超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）以进一步探索SXD的关键活性成分。我们确定了20种活性成分，其中3-（3,4-二羟基苯基）乳酸、丹参素和海南黄芩苷D的含量排名前三。此外，我们进行了分子对接，发现这些单体都能与REV-ERBα紧密结合。其中，丹参素具有抗病毒、抗氧化、抗炎和免疫抑制的益处，以及在认知障碍中的潜在作用。最新研究表明，丹参素是夏枯草催眠作用的主要成分。因此，我们应用了化学计量学技术（CESTA），这是一种用于研究蛋白质稳定性和蛋白质-蛋白质相互作用的生化技术，发现丹参素在体外与REV-ERBα蛋白结合力很强。这些实验使我们能够正确认识作用于昼夜节律相关REV-ERBα/BMAL1负反馈通路的特定化合物。

【结论】

总之，本研究首次通过行为学分析、转录组学、分子对接及分子生物学技术揭示了SXD影响并缓解AD的新型药效机制。我们发现，SXD及其主要成分可能通过与REV-ERBα特异性结合来激活BMAL1/CLCOK通路，从而抑制IL6、IL-1β和TREM2的转录，有助于减轻神经炎症并阻断AD进展（图9）。睡眠质量和认知功能的改善表明，SXD在AD早期阶段可能特别有益，因为睡眠障碍通常先于认知能力下降。此外，SXD可能通过多方面机制减少Aβ沉积，包括抑制促炎因子以减少Aβ生成，以及促进抗炎小胶质细胞极化以增强Aβ吞噬。这些发现表明，SXD及其活性化合物在减轻AD患者与昼夜节律紊乱相关的病理影响方面具有良好的药理治疗前景。活性成分的鉴定为开发标准化的SXD疗法提供了基础。

然而，本研究仍存在一些局限性。由于SXD通过靶向Rev-erbα改善睡眠障碍以治疗AD是一个新发现，我们在选择阳性对照药物方面存在一些不确定性。在后续研究中，我们将使用助眠药、Rev-erba激动剂或拮抗剂作为阳性对照来解决这一局限。此外，在CJL实验中，每组仅有三只小鼠，与其他实验相比样本量较小。然而，以往使用类似模型的研究表明，即使动物数量较少，只要严格控制实验条件，也能获得一致且可靠的结果。未来可以考虑进行更大样本量的研究来进一步验证这些发现。此外，尽管本研究确定了SXD中与REV-ERBα相互作用的三种主要成分，但仍需进一步的实验验证来阐明每种成分的贡献及其潜在的协同效应。未来的研究将包括靶向测定，如剂量-反应实验和联合治疗，以确定每种成分如何影响REV-ERBα活性，以及它们的联合效应是否增强或调节对BMAL1/CLOCK转录的整体调控影响。

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